2001年5月，F(xiàn)DA首次頒布了官方生物分析方法指導(dǎo)¹。該題為《工業(yè)生物分析方法驗證指南》的文件作為生物分析方法指南，用來支持臨床和非臨床研究。

最近，美國藥學科學家協(xié)會（AAPS）會刊中題為“車間/會議報告----定量生物分析方法驗證和執(zhí)行：色譜和配體法最好的實踐”的文章²列出，實物標樣測得濃度的重現(xiàn)性和準確度成為具有影響的爭辯的論題。有建議提出，在已經(jīng)測試的實物標樣隨機抽取樣品重新測試，并與原值進行比較，以保證重現(xiàn)性和準確度。與原始測量數(shù)據(jù)具有顯著性差異（>15-20%）的，需要對生物分析方法進行重新評估

驗證生物分析方法有效的靈敏度和重現(xiàn)性是藥物的藥物動力學（PK）、藥物生物利用度和生物等效性產(chǎn)生可靠數(shù)據(jù)的先決條件。方法驗證證明一種生物分析方法可以符合《工業(yè)生物分析方法驗證指南》建議的最低標準，即，具有準確度、精密度、選擇性、靈敏度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。然而，重復(fù)暴露于生物基質(zhì)中，保證一個驗證生物分析方法在定量下限的精密度和準確度對每一個生物分析實驗室都是一個挑戰(zhàn)。

本研究的目標是證明Thermo Scientific公司生產(chǎn)的TSQ Vantage儀在測試大鼠血漿中帕羅西汀的高靈敏度生物分析實驗中表現(xiàn)的耐受性和重現(xiàn)性。將帕羅西汀加于大鼠血漿中，作為包括空白樣品、標樣、質(zhì)量控制標準（QCs）的一批樣品進樣測試。整批樣品包括1000個血漿樣品，用來疊加5個標準曲線，每個標準曲線200次進樣，用來測試重現(xiàn)性和離子源的耐受穩(wěn)定性。

 

HPLC泵：Thermo Scientific公司的Accela™ 泵（Thermo Fisher Scientific，San Jose, CA）

自動進樣器：CTC PAL (CTC Analytics，Basel，瑞士)

色譜柱：Thermo Scientific公司的Hypersil GOLD™ C18，50mm× 2.1 mm (3μm) （Thermo Fisher Scientific，Bellefonte，PA）

HPLC方法：線性梯度，5min內(nèi)淋洗液B（乙腈，0.1%甲酸）含量從10%到95%，淋洗液A為0.1%甲酸的水溶液；流速：1mL/min；進樣體積：10μL

質(zhì)譜儀：TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)

離子化模式：HESI-II，正離子模式

 

重現(xiàn)性是生物分析方法的一個重要參數(shù)。一種驗證的生物分析方法經(jīng)常因為生物基質(zhì)所含成分，例如蛋白質(zhì)、鹽分、糖、磷脂和其它成分的連續(xù)沉積而受限。保證長效的準確度和精密度的一個關(guān)鍵要素是一個可以非常耐受生物分析樣品中的非揮發(fā)物的存在的穩(wěn)健的離子源³。如圖1所示，TSQ Vantage在不斷暴露于含生物基質(zhì)的樣品之后，仍然可以在高靈敏度下保持良好的重現(xiàn)性。圖中在5天內(nèi)分析1000個大鼠血漿樣品（每天200個樣品）的過程中，每天測得一個標準曲線，共5個標準曲線（1-500 pg/mL）。該圖將5個標準曲線疊放以論證離子源的耐受穩(wěn)定性。

圖2所示為第一天、第三天和第五天的定量下限的色譜圖。盡管系統(tǒng)暴露在1000個大鼠血漿樣品下，第一天和第五天的信噪比（S/N）基本上沒有差別。重現(xiàn)性的穩(wěn)定性在5天內(nèi)所測得的面積比的準確度（系統(tǒng)偏差）和精密度（隨機誤差）上得到體現(xiàn)（見表1）。離子源在高靈敏度下良好的重現(xiàn)性能表現(xiàn)在，定量下限的%CV為5.44%，定量上線的%CV為1.00%。計算濃度（見表2）就變得非常重要，因為正是這些值最終影響到PK參數(shù)的研究。

 

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