免疫組化

一．固定、脫水、包埋

1.取組織放入4%多聚jia醛里面固定3-4小時，時間根據(jù)標本大小適當調(diào)整。

2.取適當大小組織放入包埋盒中，進行脫水。每個染缸液體體積約200ml，每次脫水可以裝20個包埋盒。依次進入：

     75%酒精1.5小時、95%酒精1.5小時、95%酒精1小時、無水乙醇1.5小時、無水乙醇1小時、二jia苯一號0.5小時、二jia苯二號0.5小時。

打開包埋機，分別開啟冷臺，冷點，石蠟槽，組織槽進行工作。然后用鐵飯盒承裝石蠟塊并放入包埋機組織槽中加熱溶解。將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機器組織槽中，然后再放入石蠟飯盒一號進行第二遍浸蠟，然后石蠟飯盒二號，進行三次浸蠟。

3.選大小符合的模具，先調(diào)整機器滴蠟的速度，不宜過快防止有氣泡。然后在模具中滴入液體石蠟，然后從飯盒二號中拿出浸后的包埋盒，打開用鑷子取出組織放入模具中。然后用包埋盒的另一半蓋住模具，再滴入少許石蠟后放到冷臺上冷卻。按上述步驟繼續(xù)包埋下一個蠟塊。

二．切片、制片

   1.打開切片機，固定蠟塊（可提前4度冰箱預冷一下），調(diào)整刀片和蠟塊的距離。然后調(diào)整切片厚度，先粗切，看到完整的蠟片并且有組織后切換厚度，調(diào)整到自己想要切的厚度。用力均勻，右手搖動切片，左手用毛筆接片。如片子打卷，可以用毛筆按著蠟片的邊緣再緩慢切，這樣可以得到相對平整的片子。

   2.用毛筆和鑷子將片子或者帶狀片子托起，放入水槽中展片，水溫在40度左右。然后用防脫片載玻片輕輕撈起，載玻片的邊緣盡量不要觸碰水槽底部，防止底部氣泡上浮殘留在片子上。然后標注切片編號放到烤片機上烤片30分鐘。

三．組織化學染色

1.室溫脫蠟、水化：二jia苯一號10分鐘、二jia苯二號8分鐘、二jia苯三號8分鐘、無水乙醇5分鐘、90%乙醇3分鐘、80%乙醇3分鐘、70%乙醇3分鐘。蒸餾水3分鐘*3次，PBS3分鐘*3次。

2.熱抗原修復，換新的切片架，放入水化后的切片。配置抗原修復液（一包檸檬酸鈉粉末配置2升PBS溶液），用鐵飯盒或者鍋加熱煮沸。溫度控制在96-98度。然后將切片放入熱鍋中15分鐘，最后自然冷卻室溫。PBS五分鐘*2次，蒸餾水3分鐘*2次。

3.免疫組化筆畫圈：取出組織，甩干水分，可用吸水紙吸干水珠。用組化筆畫圈圍住組織，圓圈完整。

4.滅活內(nèi)源酶活性：將切片放入濕盒中，盒中加入少量蒸餾水，滴加3%過氧化氫（二抗試劑盒中A一滴或者50微升，劑量詳見二抗說明書），室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*3次，蒸餾水水洗三分鐘。

5.封閉非特異性位點：甩干水分，吸干水珠，加山羊血清封閉液（二抗試劑盒B一滴或者50微升），放入濕盒內(nèi)，室溫10分鐘。

6.甩掉封閉液，滴加一抗蓋住組織，然后放入濕盒內(nèi)4攝氏度過夜。（一抗?jié)舛纫娍贵w說明書，提前稀釋后分裝，并在負二十度冰箱保存。每張片子一抗劑量不定，看組織面積大小，xxxxx癌組織一張20微升左右。

7.第二天，4度冰箱取出濕盒，室溫復溫30分鐘，PBS三分鐘*三次，蒸餾水洗滌三分鐘。

8.甩干水分，吸干水珠，滴加二抗（二抗試劑盒C）一滴或者50微升，室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*三次，蒸餾水水洗三分鐘。

9.每張片子滴加一滴或者50微升鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液（二抗試劑盒D），室溫孵育10分鐘，PBS三分鐘*三次，蒸餾水水洗三分鐘。

10.每張片子滴加兩滴或者100微升DAB溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘。染色合適即可終止染色，自來水沖洗。

11.蘇木素復染，1-2分鐘，細胞核變藍色即可終止，自來水或者PBS沖洗反藍（可用0.5%an水反藍）。

12.1%鹽酸酒精分化3秒，自來水沖洗三分鐘。

13.脫水：70%酒精1分鐘、80%酒精1分鐘、95%酒精2分鐘、無水乙醇4分鐘、二jia苯一號3分鐘、二jia苯二號3分鐘。

14.涼干片子后滴加適量中性樹膠封片，蓋上蓋玻片，小心氣泡。晾干半天即可。

15.顯微鏡下拍照。