看到好多寶寶關(guān)于原代提取中都有疑問，這個是我們實驗員在做原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC）時，我們這邊做的一個實驗記錄及分離步驟，僅僅供大家參考。

一、實驗材料：

SD 大鼠（4～6 周齡，雄性），大號手術(shù)剪，鑷子，50 ml 離心管，6 孔板，75% 乙醇，生理鹽水，膠原酶，25% BSA，多聚賴氨酸，DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，DMEM/F12 完全培養(yǎng)基

二、實驗儀器：

超凈工作臺，低速離心機(jī)，二氧化碳培養(yǎng)箱

三、實驗步驟：

1. 將大鼠對大鼠實行 anlesi，浸泡在 75% 乙醇中約 1 min
2. 剪開頭部皮膚，快速取出大腦，盡量保證完整性
3. 將大腦放入預(yù)冷的 DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中
4. 在超凈工作臺中，去掉外層血痂，腦膜，外層血管（平皿上操作）
5. 去掉白質(zhì)（松散狀），保留灰質(zhì)（貝殼狀的左右腦）。
6. 4 ℃ 預(yù)冷培養(yǎng)基多次清洗
7. 將大腦剪成 1 mm3 的塊狀，轉(zhuǎn)移至無菌的 50 ml 離心管中，將塊狀大腦剪碎，移液槍吹打。
8. 900 rpm 室溫離心 4 min，棄去上清，然后添加 5 ml DMEM/F12 無血清培養(yǎng)基用移液槍吹打均勻，然后補(bǔ)加 10 ml 培養(yǎng)基，加 100 μL 膠原酶Ⅱ，37 ℃ 消化 30～45 min，同時用 1 ml 多聚賴氨酸包被 6 孔板。

消化完成后加入培養(yǎng)基中和，900 rpm 室溫離心 10 min。

直接加入 15 ml 25% BAS，2 000 rpm 室溫離心 20 min。離心后離心管出現(xiàn)分層，下層深紅色（少量）為腦微血管細(xì)胞。

生理鹽水輕輕沖洗 6 孔板中多余的多聚賴氨酸，沖洗 2 次。

取下層腦微血管沉淀，加入生理鹽水混勻，900 rpm 室溫離心 5 min。用新鮮 DMEM/F12 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，重懸后轉(zhuǎn)移至 6 孔板中培養(yǎng)。