目的

掌握感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化的基本方法。

原理

受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法, 化學(xué)試劑法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。

試劑與器材

一、試劑

1、0.1mol/L CaCl₂取20ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳分析。

2、LB液體培養(yǎng)基（見實(shí)驗(yàn)一）

3、LB固體培養(yǎng)基（見實(shí)驗(yàn)一）

4、氨芐青霉素（100mg/mL）

二、器材

1、 冷凍離心機(jī)

2、 平衡天平

3、 無菌操作臺(tái)

4、 微量移液器

操作步驟

一.感受態(tài)細(xì)胞的制備(0.1MCaCl₂方法)

1、從LB固體平板挑單克隆于5ml LB液體培養(yǎng)基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×12-16h，可過夜培養(yǎng)。

2、將活化菌體按1`～5％接種到LB中，擴(kuò)大培養(yǎng)37℃×200rpm×2h，至OD₆₀₀約為0.4。

3、取培養(yǎng)好的菌液1.5 ml于一離心管中，4℃離心8 000rpm×1 min。

4、棄上清，加500 ul 0.1M CaCl₂ (滅菌預(yù)冷)洗菌體，4℃冷凍離心8000rpm×1 min。

5、徹底除去殘液, 加200 ul 0.1M CaCl₂ (滅菌預(yù)冷)，懸浮菌體。

6、冰浴靜置 30 min ，4℃冷凍離心8000rpm×1 min。

7、棄上清，加100 ul 0.1M CaCl₂ (滅菌預(yù)冷)，懸浮菌體，即為制備好的感受態(tài)細(xì)胞。

附注：

①、整個(gè)過程注意無菌操作和保持低溫。

②、培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期是制備感受態(tài)細(xì)胞的關(guān)鍵。

③、如果要求高轉(zhuǎn)化效率，不建議使用簡單深凍保存的感受態(tài)細(xì)胞。

④、LB液體培養(yǎng)基建議用不加抗生素和加抗生素的兩種培養(yǎng)基，檢查菌體是否污染。

⑤、D₆₀₀值指細(xì)胞密度，用于判斷培養(yǎng)物是否處于對數(shù)生長期。OD₆₀₀值在0.4 - 0.5時(shí)，此時(shí)培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)在20min內(nèi)加倍。

二、質(zhì)粒對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

1、將連接產(chǎn)物加入100 ul制備好的感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30 min。

2、42℃熱激90S。

3、迅速冰浴3min。

4、加入300 ul LB液體培養(yǎng)基，37℃輕搖培養(yǎng)45min。

5、加入30 ul X-gal和6 ulIPTG,混勻。

6、取100 ul涂布在含有50 ug/ml氨芐的LB固體培養(yǎng)基中。

7、37℃倒置，避光培養(yǎng)16-20 h。

8、藍(lán)白斑篩選，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。