蛋白質(zhì)的量是蛋白質(zhì)純化過程中需要檢測的一項重要指標，在計算得率或物料平衡或測定目標蛋白質(zhì)的比活/效價 (potency) 時都要涉及。有各種平臺和方法可用于蛋白質(zhì)定量。這些將會在本書的其他章節(jié)進行描述。這一章我們將集中討論水溶液中蛋白質(zhì)的分光光度檢測，它不需要酶/化學(xué)性消化，也不需要在分析前對混合物進行分離操作。

實驗步驟

1.于分析前至少 30 min 將 15uL 2-巰基乙醇加人到 5 mL OPA 儲存液中, 這一試劑可穩(wěn)定維持一天。所有熒光樣品和相關(guān)反應(yīng)在所有時間內(nèi)都需要避光。

2.蛋白質(zhì)標準品 (0.2~10 ug/mL) 和未知濃度的待測樣品在分析前需要調(diào)節(jié) pH 至 8.0?10.5。將 10 檢測樣品與 1 〇〇^xLOPA 儲存液 (含 2-巰基乙醇) 混合，于室溫下孵育 15 min。

3.加入 3 mL 0.5mol/L 的 NaOH, 混勻。

4.在激發(fā)光為 340nm, 發(fā)射光為 440~455nm 處，于熒光比色皿內(nèi)對熒光進行讀數(shù)。

5.在檢測的動態(tài)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度和熒光之間的聯(lián)系應(yīng)該是線性的，可以用來估計未知樣品的濃度。

注釋

相比基于吸光度的蛋白質(zhì)定量分析方法，這 3 種染料都提供了更好的靈敏度和動態(tài)范圍。由于染料在水溶液中的水溶性和穩(wěn)定性更佳，所以 OPA 檢測法普遍優(yōu)于熒光胺檢測法。

使用胺衍生試劑對蛋白質(zhì)進行定量具有一定的局限性，因為該檢測方法顯示出很大的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的變異性，其原因是蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的數(shù)量不同，同時它需要一個「匹配」的標準品。該檢測方法易被緩沖液中含有的甘氨酸、胺、銨離子和許多生物緩沖液中常見的硫醇所干擾，因而限制了它的應(yīng)用（表 8.1)。檢測的重復(fù)性取決于反應(yīng)的 pH、蛋白質(zhì)樣品是否含有殘余的酸性物質(zhì)等。例如，來自于沉淀操作的樣品，可減少胺的衍生率 (Youetal.，1997)。

一種非共價的胺活性染料—Epicocco，也可用于溶液中總蛋白質(zhì)量的檢測 (Sigma)，這一方法的機制已有報道 (BellandKaruso，2003;Coghlanetal.，2005)。