您的位置：首頁 > 技術(shù)文獻(xiàn) > 操作維修 > 切片石臘組織包埋的步驟
切片法，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層，材料須經(jīng)過一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過程十分繁復(fù)。在制作過程中，還要經(jīng)過一系列的物理和化學(xué)的處理，這些處理方法可根據(jù)各種不同材料的性質(zhì)要求進(jìn)行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術(shù)復(fù)雜，但是，它最能保持細(xì)胞間的正常的相互關(guān)系，能較好和較長時間地保留細(xì)胞的原貌，所以仍然是光學(xué)顯微鏡的主要制片方法。
【實驗儀器、材料和試劑】
（一）儀器：石蠟切片機、恒溫蠟箱、載玻片、蓋玻片
（二）材料：洋蔥根或小鼠肝
（三）試劑：乙醚、無水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、正丁醇、二甲苯、石蠟、甘油、雞蛋、紗布、加拿大樹膠、麝香草酚
【方法與步驟】
光學(xué)顯微鏡切片制作技術(shù)最簡單的切片法是徒手切片，但是由于組織塊往往十分柔軟，
18
切削很困難，而且無法得到十分菲薄的切片，因此必須先用某些特殊物質(zhì)滲入組織塊的內(nèi)部起支持作用，并將整個組織塊包住，然后再用精密的切片機制作切片，才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法，包埋的物質(zhì)稱為包埋劑。常用的包埋劑有石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等，水和塑料也可作為包埋劑。根據(jù)包埋劑的不同，分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等，它們各有長處，可以根據(jù)需要選用，但是使用得最多的還是石蠟切片技術(shù)。
石蠟作為包埋劑，有其獨特的優(yōu)點，例如：石蠟?zāi)芮谐鰳O薄的蠟片（2～10μm）；切片時能連成蠟帶，便于制作連續(xù)切片；操作較容易，組織塊可以包埋在石蠟中長期保存。然而石蠟切片的制作過程較長，步驟很多，一步不慎往往導(dǎo)致前功盡棄，而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮，切片時受濕度影響比較大，這些不足之處必須在制片過程中認(rèn)真對待，盡量減小它的不良影響。
石蠟切片的制作過程主要包括：取材，固定，脫水，透明，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。
1．取材
材料的好壞直接影響到切片的質(zhì)量，無論取哪一種動植物材料，以下幾點是必須注意的。
（1）植物材料選擇時須盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動物材料取用時常對動物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或?qū)游餁⑺篮笱杆偃〕鏊枰慕M織。
（2）取材必須新鮮，這一點對于從事細(xì)胞生物學(xué)研究尤為重要，應(yīng)該盡可能割取生活著的組織塊，并隨即投入固定液。
（3）切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細(xì)胞使其受到損傷。
（4）切取的材料應(yīng)該小而薄，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。
2．固定
組織和細(xì)胞離開機體后，在一定時間內(nèi)仍然延續(xù)著生命活動，會引起病理變化直至歸于死亡。為了使標(biāo)本能反映它生前的正常狀態(tài)，必須盡早地用某些化學(xué)藥品迅速地殺死組織和細(xì)胞，阻抑上述變化，并將結(jié)構(gòu)成分轉(zhuǎn)化為不溶性物質(zhì)，防止某些結(jié)構(gòu)的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會使組織適當(dāng)硬化以便于隨后的處理，還會改變細(xì)胞內(nèi)部的折射系數(shù)并使某些部分易于染色。
固定劑的作用對象主要是蛋白質(zhì)，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作時不加考慮，如要觀察這些物質(zhì)，可用特殊的方法將其固定下來。
固定劑的作用表現(xiàn)在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質(zhì)而定，同樣一種固定液對某一材料來說是良好的，但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特征是：穿透組織的速度快。，能將細(xì)胞中的內(nèi)含物凝固成不溶解物質(zhì)，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存劑作用。 固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。
簡單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細(xì)胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質(zhì)都不凝固。
簡單固定劑的局限性較大，如將其適當(dāng)混合，制成復(fù)合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：
Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等。固定劑的種類甚多，我們必須依據(jù)各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。 19
固定時，須注意以下幾點：
（1）固定劑應(yīng)有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。
（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質(zhì)，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液。
（3）材料固定后如不立即下沉，可將其中氣泡抽出。
（4）固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾十小時，有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強，作用時間應(yīng)嚴(yán)加控制，不能過長。
（5）一般固定劑都以新配制的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者，一定要在使用前才混合。
（6）固定完畢，根據(jù)所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉淀，影響以后組織塊的染色。
3．脫水
生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時石蠟無法滲入組織內(nèi)部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。
脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水后必須再經(jīng)過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水后即可直接透蠟。
常用的脫水劑是乙醇，因為它價格便宜，易于得到。為了避免劇烈的擴(kuò)散引起的組織的強烈收縮，脫水步驟應(yīng)從低到高以一定的濃度梯度來進(jìn)行，一般組織從30％乙醇開始，經(jīng)過50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對于一些柔軟的組織應(yīng)從15％開始。脫水時間依據(jù)組織的類型和大小而定，一般各級乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓，應(yīng)使材料停留在70％乙醇中，因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時間不能過長，另外，脫水必須在有蓋瓶中進(jìn)行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期保存，可加入等量的甘油。
丙酮也是很好的脫水劑，其作用和用法與乙醇相同，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強。
甘油常用于藻類、菌類及柔弱材料的脫水。
二氧六環(huán)為無色的石蠟溶劑，對組織沒有收縮及硬化等不良后果，但其蒸氣有毒，使用時須小心。
正丁醇可與水及乙醇混合，亦為石蠟溶劑，其優(yōu)點是很少引起組織塊的收縮與變脆。
叔丁醇的性質(zhì)、作用和用法同于正丁醇，但因其價格昂貴而很少使用。
4．透明
組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經(jīng)過透明。透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑后，石蠟便能順利地滲入組織。
透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。
二甲苯作用較快，透明力強，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時若脫水不凈，就會引起不良后果，在應(yīng)用時必須特別小心。通常將組織塊先經(jīng)純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進(jìn)入純二甲苯，這樣可減少上述的缺點。透明時間應(yīng)由組織大小而定，—般各級停留時間在30min至2h，在純二甲苯中應(yīng)更換2次，總時間則以不超過3h為宜。材料經(jīng)過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態(tài)。 20
甲苯的一般性質(zhì)與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點較低，透明較慢，但不會使組織變脆。
苯的用法同于二甲苯，對組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適于大塊組織的透明。
5．透蠟和包埋
包埋用的石蠟，熔點在50～60℃之間，應(yīng)根據(jù)材料本身的硬度、切片的厚薄和當(dāng)時的氣溫條件來選用。一般動物材料最常用的石蠟熔點為52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時選用52～54℃的石蠟可順利切片，冬季可用熔點46～48℃的石蠟，夏季可選56～58℃的。
石蠟的優(yōu)劣與切片的成敗密切相關(guān)。鑒別石蠟質(zhì)量的方法是：將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結(jié)且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點出現(xiàn)，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細(xì)粒。這種石蠟即為品質(zhì)優(yōu)良。含有雜質(zhì)的新蠟或用過的廢蠟可清潔后再用，方法是將石蠟放入鍋內(nèi)，加熱到開始冒白煙，然后用小火繼續(xù)加熱30min（注意別超過發(fā)火點），使其去除水分和揮發(fā)性雜質(zhì)，并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。
透蠟須在恒溫箱中進(jìn)行，恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點3度，使經(jīng)過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應(yīng)處理2～3次，透蠟的時間依材料性質(zhì)而定，一般每次需15～30min。
透明的關(guān)鍵是控制溫度的恒定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟?zāi)虩o法滲透，溫度過高使組織收縮發(fā)脆。
包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準(zhǔn)備好紙盒（具體折法見圖1-3及說明），將熔蠟倒入盒內(nèi)，迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⒓埡邪慈胨�，使其迅速冷卻凝固，30min后取出。
包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會產(chǎn)生結(jié)晶。以后切片時引起碎裂。
6．切片
（1）石蠟塊的固著與整修
在包埋以后，就可進(jìn)行切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機進(jìn)行切片前還須進(jìn)行固著和整修。
固著：一般旋轉(zhuǎn)式切片機上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤，這也可用同樣大小的臺木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上，并使組織塊朝外，便于以后迅速切出所需的片子。
整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長方形。還可削去一角以便于在蠟帶上識別切片。
（2）切片機和切片刀
切片機是用來作各種組織切片的一種專門設(shè)計的精密機械，常用的是旋轉(zhuǎn)式切片機，它的夾物部分是上下移動前后推進(jìn)的，而夾刀部分則固定不動。主要部件是安裝切片刀的刀臺、安裝包埋塊的標(biāo)本臺和控制切片厚度的微動裝置。切片時切片刀固定不動，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)輪，標(biāo)本臺上下運動并按調(diào)好的切片厚度向前推進(jìn)一定的距離，組織塊上下運動一次，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。
切片刀與切片的質(zhì)量直接相關(guān)。切片前必須磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨，使用完畢后應(yīng)及時用二甲苯將石蠟油擦凈。
（3）切片方法
切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進(jìn)行切削。將所要切的包埋塊固定在標(biāo)本臺上，使包埋塊外切面與標(biāo)本夾截面平行，并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣后松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度，調(diào)節(jié)時應(yīng)注意指針不可在兩個刻度之間，否則容易損傷切片機，將刀臺移至近標(biāo)本臺處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時就可以開始切片了。方法是：右手轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)輪，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度后，右手停止轉(zhuǎn)動，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放于襯有黑紙的紙盒內(nèi)，注意切片速度不宜太快，搖動轉(zhuǎn)輪用力應(yīng)均勻，防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻，還應(yīng)注意轉(zhuǎn)動的方向，以防標(biāo)本臺后移而切不到片子。切片完畢，應(yīng)及時用氯仿將切片機的有關(guān)部分擦凈。
（4）切片中存在的問題及補救方法
石蠟切片是很不容易掌握的，有時很容易成功，有時則由于某種因素而造成切片的質(zhì)量低劣，甚至完全失敗。現(xiàn)將切片時經(jīng)常遇到的一些缺點、可能的原因以及補救辦法列于表1-3。
關(guān)鍵詞：
① 凡本網(wǎng)注明"來源：易推廣"的所有作品，版權(quán)均屬于易推廣，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用。已獲本網(wǎng)授權(quán)的作品，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)
使用，并注明"來源：易推廣"。違者本網(wǎng)將追究相關(guān)法律責(zé)任。② 本信息由注冊會員：上海億欣生物科技有限公司 發(fā)布并且負(fù)責(zé)版權(quán)等法律責(zé)任。
易推廣客服微信
