RT- PCR反應(yīng)原理

1. 從細(xì)胞或特定組織中提取總RNA。
2. 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。
3. 擴(kuò)增內(nèi)參和目的基因并比較基因表達(dá)差異。

RT-PCR反應(yīng)受多個因素影響，
如硫酸鎂的濃度, 引物退火的溫度，擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)等。

 

　　◇建議選擇0.5-3.0 mM （相差0.5 mM）的硫酸鎂作初步實(shí)驗(yàn)。

 

　　◇對于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應(yīng)有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。

 

　　◇大多數(shù)目標(biāo)RNA經(jīng)40輪PCR反應(yīng)就能觀察到。但如果目標(biāo)RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴(kuò)增的次數(shù)到45-50次。

隨機(jī)引物	適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。
Oligo dT	適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要結(jié)合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。
基因特異性引物	與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的情況。天為時 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特別適合于與基因特異性 引物連用。