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附錄XX    氨基酸分析法

氨基酸分析法是指用于測定蛋白質、肽及其他藥物制劑的氨基酸組成或含量的方法。

根據(jù)氨基酸組成分析可以對蛋白質及肽進行鑒別，氨基酸分析法可用于確定蛋白質、肽及氨基酸的含量，及測定可能存在于蛋白質及肽中的非典型氨基酸。進行氨基酸分析前，必須將蛋白質及肽水解成單個氨基酸，具體水解方法由各品種項下規(guī)定。蛋白質及肽水解后，其氨基酸分析過程與用于其他藥物制劑中游離氨基酸的分析過程相同。

本法包括四種柱前衍生法，分別為異硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯（AQC）法、鄰苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法，以及一種茚三酮柱后衍生法。不同的品種應針對自身所含的氨基酸種類及各氨基酸的含量選擇適宜的氨基酸分析方法并做相應的方法學驗證。

由于本法衍生過程中衍生溶液量較少，且容易揮發(fā)，外標法極易出現(xiàn)較大的誤差，建議采用內標法進行測定，內標的確定由各品種項下規(guī)定。在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生產物不穩(wěn)定，因此對于含半胱氨酸或胱氨酸的樣品衍生后應盡快測定，或者在衍生前對半胱氨酸或胱氨酸進行適當?shù)奶幚恚�使其轉化為穩(wěn)定地產物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生測定，具體方法由各品種項下規(guī)定。在測定過程中，可根據(jù)所用的儀器、色譜柱品牌、色譜柱的長度及要分離的氨基酸種類，對流動相的有機溶劑和洗脫梯度作適當調整以獲得較好的分離度。

第一法 PITC柱前衍生氨基酸分析法

本法系根據(jù)氨基酸與異硫氰酸苯酯（PITC）反應，生成有紫外響應的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸經反相高效液相色譜分離后用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～1.25µmol/ml。

試劑  （1）流動相A    0.1mol/L醋酸鈉溶液（取無水醋酸鈉8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸調pH至6.5，然后加水至1000 ml）-乙腈（93:7）。

（2）流動相B  乙腈－水（8：2）。

對照品溶液   按各品種項下規(guī)定的方法制備。

供試品溶液   按各品種項下規(guī)定的方法制備。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗  用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（SMA氨基酸分析色譜柱）；流速為每分鐘1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為254nm。各氨基酸峰間的分離度均應大于1.0。洗脫梯度如下：

測定法  精密量取氨基酸對照品溶液200μl，置一2ml塑料離心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混勻，精密加入0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混勻，室溫放置1小時，加0.8ml正己烷，劇烈振搖，放置10min，精密取下層溶液2μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液200μl，自“置一2ml塑料離心管中”起同法測定。

第二法 AQC柱前衍生氨基酸分析法

本法系根據(jù)氨基酸與6－氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯（AQC）反應，生成有紫外與熒光響應的不對稱尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸經反相高效液相色譜后用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為2.5～200nmol/ml。

試劑 （1）流動相A  取醋酸銨10.8g或無水醋酸鈉11.5g，加水900ml溶解，用磷酸調pH至5.0，然后加水至1000 ml。

（2）流動相B  乙腈－水（3：2）。

（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 8.8）   取硼酸12.36g，加水400ml溶解，用40％氫氧化鈉溶液調pH至8.8，然后加水稀釋至500ml。

（4） AQC溶液   取AQC適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1ml中含1mg的溶液。

對照品溶液   按各品種項下規(guī)定的方法制備。

供試品溶液  按各品種項下規(guī)定的方法制備。

色譜條件與系統(tǒng)適用新試驗  用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（SMA氨基酸分析色譜柱）；流速為每分鐘1.4ml；柱溫為37℃；檢測波長為248nm。各氨基酸峰間的分離度均應大于1.0。洗脫梯度如下：

測定法  精密量取對照品溶液10μl，置一直徑為0.4cm、高度為5cm的小試管中，精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 8.8） 70μl，在渦旋混勻器上混勻，精密加入AQC溶液20μl，混勻，精密量取5μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液10μl，自“置一直徑為0.4cm”起同法測定。

第三法  OPA和FMOC柱前衍生氨基酸分析法

本法系根據(jù)一級氨基酸，在巰基試劑存在下，首先與鄰苯二醛（OPA）反應，生成OPA-氨基酸；反應完畢后，加入9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩余的二級氨基酸與FMOC繼續(xù)反應，生成FMOC-氨基酸，兩次反應生成的氨基酸衍生物經反相高效液相色譜分離后用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～2.5µmol/ml。

試劑 （1）流動相A  稱取醋酸鈉7.5g，加水4000ml溶解，加三乙胺800μl，四氫呋喃24ml，混勻，用2％醋酸調pH至7.2。

（2）流動相B  稱取醋酸鈉10.88g，加水800ml溶解，用2％醋酸調pH至7.2，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混勻。

（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 10.4）   取硼酸24.73g，加水800ml溶解，用40％氫氧化鈉溶液調pH至10.4，然后加水稀釋至1000ml。

（4）OPA溶液  取 OPA 80mg，加0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 10.4） 7ml，加乙腈1ml， 3-巰基丙酸125μl ，混勻 。

（5）FMOC溶液  取FMOC 40mg , 加乙腈8ml溶解。

對照品溶液   按各品種項下規(guī)定的方法制備。

供試品溶液  按各品種項下規(guī)定的方法制備。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗  用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×150mm， 5μm）；柱溫為40℃；檢測波長為338nm（一級氨基酸），262nm（二級氨基酸）。各氨基酸峰間的分離度均應大于1.0。洗脫梯度及流速如下：

測定法  精密量取對照品溶液50μl，置一1.5ml塑料離心管中， 精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 10.2） 250μl，混勻，精密加OPA衍生劑50μl，混勻，放置30秒，精密加入FMOC衍生劑50μl，混勻，精密量取4μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液50μl，自“置一1.5ml塑料離心管中”起同法測定。

附注：1、由于OPA-氨基酸不穩(wěn)定，因此衍生后應立即進行分離測定。

2、本方法的衍生過程也可由自動進樣器完成。

第四法 DNFB柱前衍生氨基酸分析法

本法系根據(jù)氨基酸與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應，生成有紫外響應的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸經反相高效液相色譜分離后采用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為30～140 pmol。本法所用的2，4－二硝基氟苯屬易爆、劇毒物質，有強致癌性，且該法對色譜柱要求較高，易損壞色譜柱，衍生試劑水解生成的2，4-二硝基苯易干擾絲氨酸的測定。除另有規(guī)定外，一般不宜采用本法。

試劑  （1）流動相A） 0.05mol/L醋酸鈉溶液（取  4.1g無水醋酸鈉，加水800ml溶解，加二甲基甲酰胺10ml，用稀醋酸調pH至6.4，用水稀釋至1000 ml）。

（2）流動相B  流動相A-乙腈（1：1）。

對照品溶液   按各品種項下規(guī)定的方法制備。

供試品溶液   按各品種項下規(guī)定的方法制備。

色譜條件與系統(tǒng)適用新試驗  用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鐘1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為360nm。各氨基酸峰間的分離度均應大于1.0。洗脫梯度如下：

測定法  精密量取氨基酸對照品溶液2ml，置一50ml量瓶中，加0.5mol/L碳酸氫鈉溶液2ml，2，4-二硝基氟苯衍生化試劑（量取2，4－二硝基氟苯1ml ，用乙腈稀釋至100ml）1ml，混勻，在60℃水浴中反應 1小時，取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液2ml，自“置一50ml量瓶中”起同法測定。

第五法  茚三酮柱后衍生氨基酸分析法

本法系根據(jù)氨基酸經陽離子交換色譜柱分離后，與茚三酮反應，一級氨基酸生成在570nm處具有最大吸收的紫色化合物，二級氨基酸（如脯氨酸）生成在440nm具有最大吸收的黃色化合物，分別在570nm和440nm下檢測上述反應產物，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為20～500 pmol。

試劑 （1）流動相A  取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸1.5ml，加水溶解并稀釋至100ml，用鹽酸調pH至3.0。

（2）流動相B  取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸0.7ml，加水溶解并稀釋至100ml，用鹽酸調pH至4.3。

（3）流動相C  取氯化鈉5g，無水檸檬酸鈉1.9g，苯酚0.1g，加水溶解并稀釋至100ml，用鹽酸調pH至6.0。  

（4） 色譜柱再生溶液  取氫氧化鈉0.8g，加水溶解并稀釋至100ml，用鹽酸調pH至13。

（5）柱后衍生試劑   取茚三酮18g，茚氮蘭0.7g，加76.7％二甲基亞砜－0.7二水合醋酸鋰－0.1％醋酸溶液900ml使溶解，在氮氣下混合至少3小時。

（6）樣品緩沖液  2％無水檸檬酸鈉-1％鹽酸-0.5％硫代二乙醇－0.1％苯甲酸溶液。

對照品溶液   按各品種項下規(guī)定的方法制備。

供試品溶液   按各品種項下規(guī)定的方法制備。

色譜條件與系統(tǒng)適用新試驗  用磺化苯乙烯－二乙烯苯共聚物為填充劑（4.0×120mm， 7.5μm）；流動相流速為每小時14.0ml；柱后衍生試劑得流速為每分鐘7ml，反應器溫度為135℃；檢測波長為440nm（一級氨基酸），570nm（二級氨基酸）。各氨基酸峰間的分離度均應大于1.0。洗脫梯度如下：開始時用流動相A平衡色譜柱，在25分鐘流動相的組成變?yōu)?/font>100％流動相B，在37分鐘，流動相組成變?yōu)?/font>100％流動相C，在75min，最后一個氨基酸被洗脫后，用色譜柱再生溶液再生色譜柱1分鐘。柱溫程序如下：開始時柱溫48℃，11.5分鐘后，以每分鐘3℃的速率升至65℃，約35分鐘后，以每分鐘3℃的速率升至77℃，最后在約52分鐘后，以每分鐘3℃的速率降至77℃。

測定法   精密量取氨基酸對照品溶液適量，注入氨基酸分析儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液適量，同法測定。

附注：不同品牌的氨基酸分析儀，應根據(jù)儀器的要求，對流動相、色譜柱再生溶液、衍生試劑、緩沖液和洗脫梯度作適當調整。