1、抗原熱修復(fù)溫度和時間的關(guān)系

    我們?nèi)粘９ぷ髦兴�使用的組織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過程如下：
    第一步基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物
    第二步基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋
    上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個最關(guān)鍵的因素是溫度和時間，有人將這兩種因素對抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式：
    抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度（T） × 加熱時間（t）
    也就是說當(dāng)我們修復(fù)時的溫度越低則需要修復(fù)的時間就越長；反過來當(dāng)修復(fù)溫度增高時修復(fù)的時間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關(guān)系從抗體的實驗結(jié)果表1中也可以清楚地看出。
             

                        2、組織固定時間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系
    大量的實驗表明，固定時間越長的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時間的延長，組織中蛋白對溫度的耐受也相應(yīng)增高（如圖1所示），這可能就是我們對固定時間長的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。
圖一 固定時間和變性的關(guān)系
    這就提醒我們在做回顧性的研究時一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長修復(fù)的時間或提高修復(fù)所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。

                        3、不同PH值抗原修復(fù)液對染色結(jié)果的影響
    抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液PH值也會對染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。PH值對染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況。
    A―穩(wěn)定型，PH值對染色結(jié)果影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。
    B―V型，高PH值和低PH值染色較好，而PH值4-5染色結(jié)果較差，如ER、Ki-67等。
    C―上升型，隨著PH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如HMB45等。
    D―下降型，隨著PH值的增加染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類型的抗體只是個別的現(xiàn)象，如MOC31。     一個有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高PH值（圖中圓圈所示約PH8.0~9.0），A、B、C三者都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高PH值得修復(fù)液，如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實驗室都在使用PH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高PH值得修復(fù)液來代替目前廣為使用的PH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗證，絕大多數(shù)的抗體使用PH9.0得修復(fù)液效果都要優(yōu)于PH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高PH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢。
                        4、抗原熱修復(fù)的手段
微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)的比較
                溫度    壓力   v時間    受熱
    微波爐    100℃    1P    15~20分鐘不均勻
    高壓鍋    120℃    1.2P  噴氣2分鐘 均勻
    目前抗原熱修復(fù)所采用的方法主要有微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)兩種，從表中可以看出，由于高壓鍋修復(fù)具有溫度均一、節(jié)省時間、效果穩(wěn)定等特點，已經(jīng)越來越受到人們的青睞。

                        石蠟切片免疫組化染色步驟
                三步法（以SP試劑盒為例）
    ●石蠟切片脫蠟至水。
    ●蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行。
    ●3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次。
    ●5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。
    ●PBS沖洗，2分鐘×3次。
    ●滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。
    ●PBS沖洗，2分鐘×3次。
    ●滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。
    ●PBS沖洗，2分鐘×3次。
    ●顯色劑顯色（DAB或AEC）。
    ●自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明、封片。
    ●如果必要，可選用avdin封閉內(nèi)源性生物素。

                        冰凍切片的免疫組化染色步驟
    ●速凍組織
    ●冰凍切片4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲存于-20℃冰箱。
    ●室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘。也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式。
    ●PBS沖洗，5分鐘×3次。
    ●用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
    ●PBS沖洗，5分鐘×3次。
    ●下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）。

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