逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR操作注意事項(xiàng)

RT-PCR操作有三步：
第一，ＲＮＡ提純；第二，�。遥阅孓D(zhuǎn)錄；第三，ＰＣＲ聚合酶反應(yīng)，

（1. ）做RT前必需測(cè)RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對(duì)RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug
（2. ）RT按要求做，一般不會(huì)出太大問(wèn)題。
（3. ）PCR，按常規(guī)。但如需擴(kuò)長(zhǎng)片段，則對(duì)前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。

RT和PCR時(shí)的引物設(shè)計(jì)有3種方法:

a）：Random 9mers；
　�。╞）：Oligo dT-Adaptor Primer；
　�。╟）：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴(kuò)增的所有的cDNA（理論上），還要用此產(chǎn)物做PCR 的模板繼續(xù)擴(kuò)增。 如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov

1.RT-PCR有兩種做法：
條件具備的話可用kit進(jìn)行一步法進(jìn)行；若條件不太好的話可分兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來(lái)發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想，條帶特異性強(qiáng)且無(wú)拖尾現(xiàn)象，我推測(cè)是體系更加單一比較利于PCR的進(jìn)行，當(dāng)然也可能是我買的kit不太好。（promega）。

2.RT-PCR應(yīng)具備的條件
高質(zhì)量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好產(chǎn)物短點(diǎn)）；若涉及粗略定量的話還應(yīng)考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內(nèi)標(biāo)分子更好，但我發(fā)現(xiàn)其實(shí)很不容易將RNA的濃度以及內(nèi)標(biāo)分子的表達(dá)量調(diào)整的完全一樣）；體系的均一性等。

3.RACE
我做過(guò)RACE（3’RACE是寶生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但現(xiàn)在再進(jìn)行另一個(gè)同源基因的3‘RACE時(shí)卻怎么也P不出來(lái)，這兩個(gè)基因是由同一對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)的，其中一個(gè)已經(jīng)獲得了全序列（RACE的方法），而另一個(gè)基因的3’UTR卻增么也擴(kuò)不出來(lái)，我推測(cè)是不是該基因的3‘UTR太長(zhǎng)的緣故，我都快綠了，有無(wú) RT-PCR的常用內(nèi)標(biāo)b－actin 和GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細(xì)胞，不同的刺激。

3有關(guān)內(nèi)參的幾點(diǎn)建議：

一定要做內(nèi)參的，每一次，我想。不作內(nèi)參的結(jié)果是不可信的。

（1）半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對(duì)表達(dá)量，不是絕對(duì)表達(dá)量；
（2）以電泳為基礎(chǔ)的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實(shí)驗(yàn)的粗篩是可以的，但不能作為最終結(jié)果的；
（3）半定量RT-PCR和定量RT-PCR應(yīng)該在同一個(gè)管中進(jìn)行，內(nèi)參基因和目的基因表達(dá)率相同，長(zhǎng)度差不多，GC含量相似。
我覺(jué)得做RT-PCR的方法和條件及應(yīng)注意的事項(xiàng)總結(jié)出幾條,　許多專業(yè)書(shū)都有詳細(xì)的描述,　但是許多人還是歷經(jīng)多次磨難，有時(shí)就是得不出結(jié)果。因此，我認(rèn)為因?yàn)槊總�(gè)人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對(duì)不同的人來(lái)說(shuō)還是有他自己的特殊性,　做實(shí)驗(yàn)時(shí)各人的情況不同,　做不出時(shí)還是要好好動(dòng)一下腦子。

防止RNA酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。
6. 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。

常用的RNA酶抑制劑

1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。

Real-Time PCR實(shí)時(shí)定量操作注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)中養(yǎng)成的一些好習(xí)慣

（1） 加入試劑之前,把它混勻一下,以免放置時(shí)間長(zhǎng)了濃度不均
（2） 移液槍用完之后要?dú)w到最大計(jì)量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性
（3） 一定要記著關(guān)水浴箱，切記切記
（4） 多和大家討論，同時(shí)多關(guān)注別人討論的經(jīng)驗(yàn)，這幾乎是最快提高的捷徑了
（5） 所有的試劑都自己配，出了問(wèn)題才好找原因。

一、防止RNA酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180度的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37度處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。
6. 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。

二、常用的RNA酶抑制劑

1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。

因?yàn)镈EPc不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA，因此在分離和純化RNA過(guò)程中不能使用，而且它與一些緩沖液（例如Tri）不能相容

在所有RNA實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。

研究人員造成的污染 RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)勤換手套。

但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而 含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理

（一）動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法
　　Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無(wú)蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交， Poly（A） 分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。

　　1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。

　　2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。

　　3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。

　　4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4度下7500g離心5分鐘。

　　5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55度-60度水溶 10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70度。


總mRNA的提取（自己的經(jīng)驗(yàn)）

一、 關(guān)于Trizol Reagent需要的試劑
1． Chloroform：氯仿 （分析純）
2． Isoproplyl alcohol：異丙醇（分析純）
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析純無(wú)水乙醇并用0.01%的DEPC
　　處理過(guò)的無(wú)Rnase的水稀釋。
4． RNase-free water：無(wú)Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml
　�。�50ul），在37度過(guò)夜，并高壓滅菌即得（150度3小時(shí)）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌

二、 關(guān)于Trizol Reagent的使用過(guò)程：

Homogenization（勻漿）
　　a. Tissues：組織
　　　每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過(guò)Trizol試劑的10%。
　　b. Cells Grown in monolayer（單層細(xì)胞接毒后出現(xiàn)病變的）
　　　針對(duì)JEV細(xì)胞總RNA的抽提法：

BHK21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37度吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。出 現(xiàn)75%-100%的病變時(shí)，以PBS（預(yù)冷）沖洗細(xì)胞兩次，直接在細(xì)胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細(xì)胞（細(xì)胞瓶有兩 種常用規(guī)格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細(xì)胞瓶而定，以蓋滿瓶 底為度，而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量，否則可導(dǎo)致DNA的污染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮）

（1） 組織接入預(yù)冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易污染），混勻，吹吸幾次，以破裂細(xì)胞，置室溫5min，以使核蛋白復(fù)合物徹底分離。

（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入氯仿0.2ml），蓋好，劇烈震蕩15s，置室溫2-3分鐘。

（3） 4度離心，10000g，15min，離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、
　　　上層為無(wú)色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當(dāng)于所加的Trizol試劑量的60%。

（4） 仔細(xì)吸取上層水相，移至另一EP管中。

（5） 加0.5ml異丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。

（6） 4度離心，10000g，10min。RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。

（7） 棄上清液，加入預(yù)冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震蕩，充分洗滌沉淀，4度離心，5500g，5min。棄上清液，空氣干燥（或真空干燥）后，沉淀重懸于無(wú) Rnase dH2O中，吹吸幾次，55，-60度作用10分鐘以溶解RNA，-70度保存?zhèn)溆谩?br />
（8） 抽提出的細(xì)胞總RNA干燥后加水50ul，取10ul加無(wú)Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以無(wú)Rnase水為對(duì)照，在721型紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)為：A260/280 ratio<1.6。

（9） 分離組織10mg（純組織）加800ul Trizol試劑。

（10） 擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

DEPC處理方法如下：

1. DEPC處理

（1）DEPC水：100ml超純水加入0.2ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。

（2）Tip頭（槍頭）、EP管等在提RNA過(guò)程中及做RT時(shí)接觸RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip頭；EP管和PCR反應(yīng)管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37度浸泡過(guò)夜，高壓滅菌。

2. 提取RNA，用DEPC水溶解

3. RT，我是用PCR儀來(lái)控制溫度和時(shí)間的，所以RT是在PCR反應(yīng)管中作的。

4. 操作過(guò)程中要戴一次性手套，并經(jīng)常換手套。最好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，槍頭盒插好槍頭后，加入1-2ml的0.1度C水，在滅菌就行了；現(xiàn)在有進(jìn)口的RNASE FREE的槍頭買，直接用不用處理的。