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基因組DNA的純化一般是通過裂解液處理樣品,裂解細胞,將DNA從細胞核中釋放出來,并使gDNA與蛋白質(zhì)分開,DNA仍留在上清液中,通過后續(xù)的異丙醇沉淀將DNA沉淀分離出來。
1、樣品的收集和保存
請盡量使用新鮮的組織材料,采集樣品如果不馬上用于提取實驗,請置于-20℃或者-70℃以下存放。期間應(yīng)避免反復(fù)凍融,使用反復(fù)凍融或長時間未低溫冷藏的樣品進行DNA的提取,所提取的DNA片段可能不完整,或收獲量低。對于較難破碎細胞壁的細菌和酵母細胞,應(yīng)盡量收集處于生長對數(shù)期的菌體,以取得最佳實驗效果。
2、樣品處理方式
樣品材料進行破碎(及勻漿)可以提高裂解效率,組織破碎后可以充分與裂解液接觸,利于裂解。不同來源的組織材料,根據(jù)組織成份的差異,樣品處理的方式也有所差異。一般來說,樣品的破碎方式,主要有液氮研磨、勻漿和蛋白酶K消化。
·細菌及酵母:細菌需要加入溶菌酶(Lysozyme)破碎細胞;酵母細胞需要加入溶壁酶(Lyticase)破碎細胞壁。
·動物組織:一般需要加入蛋白酶K消化的組織,無需液氮研磨、勻漿,盡量剪碎即可(如老鼠尾巴,加入蛋白酶K消化1-4小時即可)。充分破碎可以減少裂解時間,可使用玻璃勻漿器。
·植物組織:必須液氮研磨破碎。
3、DNA的洗脫
在低鹽的條件下DNA可以很容易的從硅膠膜上洗脫下來,洗脫液的采用低鹽緩沖液(10mM Tris –HCL,pH8.5)。洗脫液pH值在7.0~8.5之間時,洗脫效率最大,如果用ddH2O進行洗脫,請保證pH值在此范圍內(nèi)。
注:將洗脫緩沖液65℃預(yù)熱,進行洗脫,將會提高洗脫效率。
4、DNA檢測
純化到的基因組DNA,OD260/OD280一般會在1.7~1.9之間,電泳檢測時,電泳條帶跟上樣量以及瓊脂糖凝膠濃度有很大關(guān)系,純化到基因組DNA理想狀態(tài)下為單一條帶,但是往往由于提取過程中,操作等原因,電泳顯示略有拖尾,屬于正,F(xiàn)象。
5、DNA保存和穩(wěn)定性
DNA分子在堿性條件下可以穩(wěn)定存在,試劑盒所用洗脫液pH為8.5的緩沖液,可以穩(wěn)定保存DNA分子。實驗室所用ddH2O其pH值往往小于7.0,長時間保存,DNA容易發(fā)生降解。
長期保存時,應(yīng)置于-20℃或-80℃,并且避免反復(fù)凍融。
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