【摘要】 目的建立一種檢測鷹嘴豆異黃酮含量的快速分析方法，并檢測鷹嘴豆和豆芽中異黃酮的含量。方法采用紫外分光光度法，檢測波長為260.9 nm，測定鷹嘴豆及其豆芽中異黃酮的含量測定。結果鷹嘴豆芽素A在2～30 μg/ml范圍內吸光度與濃度呈良好的線性關系，以黃酮總含量測定結果重復性RSD=1.95%，加樣回收率為100.18%。結論為鷹嘴豆提取物及制品提供一種簡單、可靠、有效的測定方法。

　　【關鍵詞】 鷹嘴豆 豆芽 異黃酮 紫外分光光度

　　鷹嘴豆是豆科鷹嘴豆屬鷹嘴豆Cicer afiefinum L．的成熟種子，為一年生栽培植物，維吾爾語稱其為諾胡提（音譯），主要種植在新疆、甘肅等地區(qū)，是維吾爾族人常用的藥食兩用的食品，有治療糖尿病、高脂血癥、支氣管炎、性欲降低等疾病的作用。

　　有關鷹嘴豆中異黃酮的報道不多，譚永霞等［1］從鷹嘴豆中分離得到異黃酮，關于鷹嘴豆異黃酮的含量測定及其方法均未見報道。本研究用自制的鷹嘴豆芽素A為標準品，在紫外最大吸收峰260.9 nm處測定了鷹嘴豆和其豆芽異黃酮含量，豆芽中異黃酮含量達到5.057%，并確定了鷹嘴豆異黃酮含量測定方法。

　　1 材料與儀器

　　鷹嘴豆為木壘縣產(chǎn)的“Desi”品種，豆芽經(jīng)常規(guī)發(fā)芽得到，鷹嘴豆豆芽素A對照品為本實驗室分離制備；試劑均為分析純。

　　SHIMADZU UV-2550型分光光度計；戴安P680高效液相色譜儀；UVD170u型紫外檢測器；Chromeleon型色譜工作站；超聲波清洗器（KQ-250B型）；電子天平（SEJ180-4型）。

　　2 方法

　　2.1 樣品液的制備精確稱取2.0 g鷹嘴豆粉和干燥后的鷹嘴豆豆芽粉（過25目篩），每一樣品平行作兩份，溶于20 ml的甲醇中，采用超聲波提取3次，功率為59 kHz，溫度為25℃ ，提取時間為45 min，過濾，合并濾液，測定吸收值，每一樣品測3次，取6個測定的吸收值均值為該樣品的吸收值。

　　2.2 標準品的制備和標準溶液的配制

　　2.2.1 標準品的制備鷹嘴豆豆芽提取物經(jīng)硅膠柱、SephadexLH20層析后得到化合物，再經(jīng)制備HPLC進一步純化，歸一法其純度為98.96%，經(jīng)1H-NMR，13C-NMR結構鑒定：黃色針狀結晶，mp 216～217℃（CH3OH）。 H-NMR（DMSO-d6）6： 8．35（1H，s，H-2），7．49（2H，d，J=8．4 Hz，H-2 ，6 ），6．99（2H，d，J=8．7 Hz，H-3 ，5 ），6．41（1H，d，J=2．1 Hz，H-8），6．24（1H，d，J=1．8 Hz，H-6），3．78（3H，s，OCH3）；13C-NMR（DMSO-d6）6：154．4（C-2），122．7（C-3），179．9（C-4），161．5（C-5），98．7（C-6），163．9（C-7），93．6（C-8），157．5（C-9），104．3（C-10），121．9（C-1 ），130．0（C-2 ），113．6（C-3 ），159．0（C-4 ），113．6（C-5 ），130．0（C-6 ），55．0（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［2］一致，故鑒定化合物為鷹嘴豆芽素A（biochanin A）。

　　HPLC制備色譜條件：ODS-A色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm）；流動相MeOH-H2O（80∶20）；進樣量 1 ml；流速7 ml/min；檢測波長260 nm。色譜圖見圖1。

　　2.2.2 標準溶液的配置精確稱取已純化的鷹嘴豆芽素A標準品5.0 mg，置于25 ml容量瓶中，以甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，濃度為200 μg/ml。

　　2.3 波長的選擇分別取一定濃度的標準溶液和樣品液，在波長為200～400 nm的紫外區(qū)范圍進行掃描，測定參數(shù)為Abs，中速，采樣間隔為1 nm，記錄范圍-1.638～4.000，根據(jù)紫外吸收光譜圖確定其測定波長。

　　 2.4 標準曲線的繪制精確吸取0.10，0.20，0.40，0.50，1.00，1.50 ml標準品溶液分別置于6個10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。以甲醇作空白對照，在波長最大吸收峰處測定吸光度，得到以鷹嘴豆芽素A溶液濃度C為橫坐標、吸光度值A為縱坐標的標準曲線，用最小二乘法進行線性回歸，可得標準曲線方程。

　　3 結果

　　3.1 檢測波長的確定鷹嘴豆異黃酮結構中羥基和芳環(huán)形成較強的共軛體系，對紫外光有較強的特征吸收，故選擇紫外區(qū)進行波譜掃描。鷹嘴豆芽素A標準溶液的最大吸收波長在260.9 nm處，樣品液的最大吸收波長也在260 nm處，兩者的最大吸收波長基本沒有偏差，故選擇260.9nm處作為測定波長。見圖2。

　　3.2 標準曲線方程在260.9 nm處測定一系列鷹嘴豆芽素A標準溶液的吸光度值，以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標，求得回歸方程Y=0.1218 0X 0.064 18，相關系數(shù)r=0.999 5，鷹嘴豆芽素A在2.00～30.00 μg／ml范圍呈良好線性關系。3.3 鷹嘴豆和其豆芽異黃酮的含量在紫外最大吸收峰260.9 nm下，測的鷹嘴豆和豆芽的異黃酮含量，每個樣品測3次，2個平行樣。測得結果：鷹嘴豆異黃酮含量為0.016%；鷹嘴豆豆芽異黃酮含量為5.057%。

　　3.4 穩(wěn)定性實驗分別取一定量新鮮配制的標準溶液和樣品溶液，在動力學窗口，吸收波長260.9 nm下測定其吸收值，觀察其穩(wěn)定性，每隔15 min取一測定值。結果放置7 min測得的吸光度值穩(wěn)定不變；將放置7 min測得的吸光度值作為0 min，并每隔30 min測定1次，結果標準溶液在所試3 h內相對標準偏差RSD=0.8％，樣品溶液在所試3 h內RSD=1.3％。實驗表明，鷹嘴豆芽素A標準品溶液和鷹嘴豆提取樣品液在所試3 h內穩(wěn)定。

　　3.5 重復性實驗將在一定工藝條件下所得的提取鷹嘴豆提取液隨機取6份，作為樣品溶液，分別測定吸光度值，根據(jù)標準曲線方程求得對應濃度，經(jīng)統(tǒng)計學處理，其RSD=1.95％。實驗結果表明，本方法的重復性較好。

　　3.6 精密度實驗在線性范圍內，同一樣品6次平行測定的相對標準偏差RSD< 0.1％。實驗表明，該方法的精密度較高。

　　3.7 加樣回收率實驗精密吸取0.8，1.0，1.4，1.6，2 ml鷹嘴豆芽素A標準溶液于5只25 ml容量瓶中，再分別精密加入樣品溶液5 ml，按測定程序進行測定，計算回收率。所得結果如表1。5個樣品的回收率在97.4％ ～103.4％之間，其平均加樣回收率為100.18％，RSD為2.1％。表1 回收率實驗結果

　　4 討論

　　以鷹嘴豆芽素A為標準品，采用紫外分光光度法進行鷹嘴豆異黃酮含量的測定，具有方法簡便、快速、準確、重復性好等特點，特別適于對提取分離工藝條件的實驗研究，無需專用試劑即可測定提取效率、流出曲線等指標，還可考察工藝條件的優(yōu)劣，故本方法可作為檢測鷹嘴豆異黃酮含量的一種有效手段。

　　異黃酮類化合物是廣泛存在于豆科植物中的一類生物活性物質，一直被人們用來治療心血管系統(tǒng)疾病和糖尿病。研究表明，異黃酮具有抗氧化、抗溶血、通過降低血脂和血漿膽固醇來防治心血管疾病的作用，還具有雌性激素樣作用，有利于骨質疏松癥、更年期綜合征、前列腺癌及乳腺癌的預防［3］。本文使用自外分光光度法測得鷹嘴豆中異黃酮含量是0.016%，其豆芽異黃酮含量是5.057%。由結果可以看出鷹嘴豆胚芽中異黃酮的含量要遠遠高于鷹嘴豆中的異黃酮，幾乎是鷹嘴豆中異黃酮的三百多倍。由此，可采用鷹嘴豆發(fā)芽這一簡單前處理的方法富集鷹嘴豆中的異黃酮，從而有利于鷹嘴豆異黃酮產(chǎn)品的開發(fā)。