預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中g(shù)p96含量。
實驗原理
糖蛋白96（glycoprotein96, gp96）是熱應(yīng)激蛋白家族的一個成員，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜上。近年研究發(fā)現(xiàn)，gp96作為分子伴侶可結(jié)合細(xì)胞中的肽庫。當(dāng)病毒感染或腫瘤發(fā)生時，gp96可與抗原肽結(jié)合。隨后gp96-抗原肽復(fù)合物在一個受體介導(dǎo)的作用下將抗原肽傳遞給巨噬細(xì)胞或其它抗原遞呈細(xì)胞，經(jīng)抗原遞呈途徑，抗原肽被遞呈給MHCⅠ類分子，進(jìn)而激活特異性CTL和記憶性T細(xì)胞，引起機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)。通常認(rèn)為，在這個過程中g(shù)p96只起抗原傳遞載體的作用，本身沒有發(fā)生變化。
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本gp96水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入gp96抗原、生物素化的抗人gp96抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的gp96呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成
酶聯(lián)板：一塊（96孔）
標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為10 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10ng/ml，5 ng/mL，2.5 ng/mL ，1.25 ng/mL，0.62 ng/mL，0.31 ng/mL，0.15 ng/mL，其原液直接作為最高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋。
檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。
底物溶液：1×10ml/瓶。
濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

標(biāo)本的采集及保存
1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)��?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)��?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。
棄去液體，甩干，不用洗滌。
每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。
依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。
依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層
吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
    自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人gp96，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算
  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。
如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數(shù)。
5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。
檢測范圍：
0.05 ng/mL -20 ng/mL
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．有效期：6個月
3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。