【摘要】目的研究微乳介質(zhì)中丹參酮ⅡA和牛血清白蛋白的相互作用行為。方法采用熒光光度法，通過(guò)Stern�睼olmer公式計(jì)算熒光猝滅數(shù)據(jù)和結(jié)合常數(shù)，通過(guò)計(jì)算熱力學(xué)數(shù)據(jù)探討丹參酮ⅡA和牛血清白蛋白的相互作用機(jī)理。結(jié)果常溫下結(jié)合常數(shù)為1.93×104L·moL-1，且結(jié)合常數(shù)、猝滅常數(shù)均隨溫度升高而降低，熱力學(xué)數(shù)據(jù)ΔH0、ΔS0和ΔG0均為負(fù)值。結(jié)論在微乳液中，丹參酮ⅡA對(duì)牛血清白蛋白的猝滅機(jī)制屬于復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過(guò)程，其結(jié)合機(jī)制可能為范德華力和氫鍵作用力。
　　
　　【關(guān)鍵詞】丹參酮ⅡA;牛血清白蛋白;微乳液;結(jié)合力
　　
　　藥物小分子與生物大分子相互作用的研究是化學(xué)和生命科學(xué)熱門(mén)課題之一。研究血清蛋白質(zhì)與內(nèi)源性化合物及藥物相互作用的方法有熒光光譜法[1]、電化學(xué)法[2]、平衡透析法[3]、液相色譜法[4]和毛細(xì)管電泳法[5]等。作者曾用紫外分光光度法研究了微乳體系中丹參酮ⅡA（tanshinoneⅡA,Tan�并駻）和牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）的相互作用，結(jié)果表明，微乳液可以做為脂溶性藥物Tan�并駻和水溶性大分子BSA的共溶劑，并且二者在這樣一個(gè)體系中有相互作用[6]。本文通過(guò)熒光光度法進(jìn)一步證明了Tan�并駻和BSA在該體系中的相互作用，并研究了其作用機(jī)理。
　　
　　1儀器與試劑
　　
　　UV��2450型紫外分光光度計(jì)（日本島津）;F��2500型熒光分光光度計(jì)（日本日立）;Orion828型酸度計(jì)（美國(guó)奧立龍）;HH��2恒溫水浴鍋（金壇市宏華儀器廠）。
　　
　　牛血清白蛋白（BSA,相對(duì)分子質(zhì)量67000,分析純,上海生物技術(shù)有限公司），1.08×103mol/L的水溶液，于4℃冰箱中保存;丹參酮ⅡA（對(duì)照品，西安冠宇生物技術(shù)有限公司），2.51×10-3mol/L的95%乙醇溶液;冰乙酸�擦姿岐才鹚岐矚溲趸�鈉的B�睷緩沖溶液。其他化學(xué)試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。
　　
　　按照文獻(xiàn)[7]方法配制微乳液。微乳液配比組成見(jiàn)表1。表1微乳液的成分配比及結(jié)構(gòu)
　　
　　2實(shí)驗(yàn)方法
　　
　　用含水50%、pH值為7.24的微乳液作為共溶體系，固定BSA濃度在1.5×10-5mol/L，變化藥物濃度范圍10×10-6～200×10-6mol/L。充分混合均勻，20℃下靜置過(guò)夜至完全平衡。在波長(zhǎng)283nm的激發(fā)光下，熒光分光光度計(jì)掃描3個(gè)溫度（293K、298K和303K）時(shí)BSA在290～500nm范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。激發(fā)光和發(fā)射光狹縫寬度均為5nm。
　　
　　3結(jié)果與討論
　　
　　3.1微乳體系的確定
　　
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明十二烷基*鈉�舱�丁醇�舱�庚烷�舱麴s水微乳體系穩(wěn)定，對(duì)藥物的紫外光譜沒(méi)有影響。不同含水量微乳液Tan�并駻和BSA的溶解度實(shí)驗(yàn)表明:含水量10%～30%的微乳液可溶解Tan�并駻，但使BSA沉淀;含水量70%～90%的微乳液可溶解BSA，但使Tan�并駻沉淀;含水量40%～60%的微乳液可同時(shí)溶解Tan�并駻和BSA。因此本文選擇含水量為50%的微乳液作為溶劑體系。
　　
　　另外，為選出能同時(shí)溶解藥物和BSA的最適宜的微乳液，對(duì)非離子活性劑80�舱�丁基酒精�舱�戊烷�菜�和十二烷基*鈉�舱�丁基酒精�舱�庚烷�菜�組成的兩種微乳液的吸收光譜分別進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果顯示由十二烷基*鈉�舱�丁基酒精�舱�庚烷�菜�組成的微乳液經(jīng)振蕩并放置一段時(shí)間待其穩(wěn)定后對(duì)光譜沒(méi)有什么影響。而在超聲波下制備的非離子活性劑80�舱�丁基酒精�舱�戊烷�菜�和十二烷基*鈉�舱�丁基酒精�舱�庚烷�菜�組成的微乳劑系統(tǒng)都不穩(wěn)定，而且在藥物光譜上顯示有很多雜質(zhì)峰。
　　
　　3.2不同介質(zhì)中BSA的熒光光譜
　　
　　分別掃描在B�睷緩沖溶液中和在pH7.24的微乳液中的BSA的熒光光譜，結(jié)果見(jiàn)圖1。比較B�睷緩沖溶液和微乳液中BSA的熒光發(fā)射光譜可見(jiàn)（λem=338nm,F=1070），在微乳中的BSA的最高峰藍(lán)移到332nm。熒光強(qiáng)度減弱到643，這可能歸因于微乳溶液的低界面張力和低黏度。
　　
　　3.3熒光法測(cè)定Tan�并駻和BSA在微乳液中的結(jié)合行為
　　
　　化合物的熒光強(qiáng)度可能因?yàn)槟承┓肿拥慕Y(jié)合而降低，測(cè)定大分子的熒光性質(zhì)可以得到小分子與蛋白結(jié)合的信息，如結(jié)合機(jī)理，結(jié)合方式，結(jié)合常數(shù)等。
　　
　　記錄283nm激發(fā)光下290～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，BSA與不同濃度的Tan�并駻反應(yīng)后的熒光光譜，見(jiàn)圖2。圖2顯示隨著Tan�并駻濃度的增加BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，且峰形均基本不變，說(shuō)明Tan�并駻對(duì)BSA的熒光有猝滅作用。通過(guò)Stern�睼olmer公式：F0/F=1 KSV[Q]計(jì)算熒光淬滅數(shù)據(jù)，式中F0為淬滅劑不存在時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入淬滅劑后的熒光強(qiáng)度，Ksv是Stern�睼olmer淬滅常數(shù)，[Q]是淬滅劑濃度。在不同的溫度下Ksv和R2的值見(jiàn)表2，Stern�睼olmer圖是線性（圖3）和向上傾斜的，表明Tan�并駻結(jié)合BSA的淬滅機(jī)制可能是靜態(tài)淬滅過(guò)程，因?yàn)镵sv值隨溫度的升高而降低，如果是動(dòng)態(tài)淬滅會(huì)出現(xiàn)相反的現(xiàn)象。
　　
　　Tan�并駻與BSA結(jié)合的信息可以通過(guò)計(jì)算熒光淬滅速度常數(shù)Kq得到進(jìn)一步確定。Kq用下式計(jì)算：Kq=Ksv/τ0,τ0是沒(méi)有猝滅劑時(shí)蛋白質(zhì)的熒光平均壽命，生物高聚物τ0值是10-8s-1[8]，因此Kq值是1012L·mol-1·s-1數(shù)量級(jí)，比最大散射碰撞淬滅常數(shù)2×1010L·mol-1·s-1大。這顯示淬滅不是由動(dòng)態(tài)的碰撞開(kāi)始的而是與化合物的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)[9]。表2根據(jù)Stern�睼olmer曲線得淬滅常數(shù)
　　
　　3.3Tan�并駻和BSA的結(jié)合常數(shù)以及相互作用力類(lèi)型
　　
　　當(dāng)小分子結(jié)合大分子，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合的位置數(shù)目可從下面的方程式得出[10]：
　　
　　logF0-FF=logK nlog[Q]
　　
　　式中，K為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。用log（F0-F）/F和log[Q]的點(diǎn)作圖能算出K和n，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可見(jiàn)，結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而降低，其結(jié)果是導(dǎo)致Tan�并駻�睟SA復(fù)合物的穩(wěn)定性降低;同時(shí)，從n的數(shù)據(jù)也可以推斷出BSA對(duì)Tan�并駻是一個(gè)單獨(dú)級(jí)別的結(jié)合位點(diǎn)。表3Tan�并駻和BSA的結(jié)合參數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)
　　
　　通過(guò)分析與溫度相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)可以進(jìn)一步說(shuō)明BSA和Tan�并駻之間的作用力類(lèi)型。小分子和大分子作用力主要含有氫鍵、范德華力、靜電力、疏水力等。從熱函的改變（ΔH0），熵值改變（ΔS0）和自由能的改變（ΔG0），可以判斷結(jié)合方式。熱力學(xué)參數(shù)可用下面的方程式計(jì)算:
　　
　　logK=-ΔH02.303RT ΔS02.303R
　　
　　ΔG0=ΔH0-TΔS0
　　
　　K和R分別是結(jié)合常數(shù)和氣體常數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。
　　
　　從表3可見(jiàn)，ΔG0≤0，說(shuō)明Tan�并駻和BSA的結(jié)合是自發(fā)的過(guò)程。負(fù)的ΔH0和ΔS0一般被認(rèn)為是在低電解質(zhì)液中范德華力和氫鍵結(jié)合的證據(jù)，靜電力相互作用中負(fù)的ΔH0值也可能扮演一定的角色[11]。但這與BSA和Tan�并駻分子結(jié)構(gòu)分析不一致，在pH=7.24時(shí)，它們都帶負(fù)電荷[12]。因此推斷，在微乳液中Tan�并駻與BSA之間的結(jié)合方式可能是氫鍵和范德華力。
　　
　　4結(jié)論
　　
　　本文以微乳液為共溶體系，用熒光分光光度法研究了脂溶性藥物分子丹參酮ⅡA與BSA的結(jié)合作用，用Scatchard方程計(jì)算了二者的結(jié)合常數(shù)，結(jié)合常數(shù)為1.93×104L·mol-1，該結(jié)果與文獻(xiàn)[6]的研究結(jié)果基本一致。通過(guò)熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算推得微乳液中丹參酮ⅡA對(duì)BSA的猝滅機(jī)制屬于復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過(guò)程，其結(jié)合機(jī)制可能為范德華力和氫鍵作用力。