高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography，簡稱HSCCC) 是一種較新型的液—液分配色譜,由美國國立健康研究院（National Institute of Health, U.S.A.）Ito博土研制開發(fā)，其原理是基于樣品在旋轉(zhuǎn)螺旋管內(nèi)的互不混溶的兩相溶劑間分配不同而獲得分離，因而無須任何固體載體或支撐體，能達(dá)到在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離和制備，并且可以達(dá)到幾千個理論塔板數(shù)。與其他柱色譜相比較，它克服了固定相載體帶來的樣品吸附、損失、污染和峰形施尾等缺點(diǎn)^[3]。目前此項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用于生化、生物工程、醫(yī)藥、天然產(chǎn)物化學(xué)、有機(jī)合成、環(huán)境分析、食品、地質(zhì)、材料等領(lǐng)域^[5]。我國是繼美國、日本之后最早開展逆流色譜應(yīng)用的國家，俄羅斯、法國、英國、瑞士等國也都開展了此項(xiàng)研究。美國FDA及世界衛(wèi)生組織（WHO）都引用此項(xiàng)技術(shù)作為抗生素成分的分離檢定，90年代以來，高速逆流色譜被廣泛地應(yīng)用于天然藥物成分的分離制備和分析檢定中。本文對高速逆流色譜的原理特點(diǎn)及應(yīng)用作一綜述。

HSCCC利用了一種特殊的流體動力學(xué)(單向流體動力學(xué)平衡)現(xiàn)象。具體表現(xiàn)為一根100多米長的螺旋空管，注入互不相溶的兩相溶劑中的一相作為固定相，然后作行星運(yùn)動；同時不斷注入另一相（流動相），由于行星運(yùn)動產(chǎn)生的離心力場使得固定相保留在螺旋管內(nèi)，流動相則不斷穿透固定相；這樣兩相溶劑在螺旋管中實(shí)現(xiàn)的接觸、混合、分配和傳遞。由于樣品中各組分在兩相中的分配比不同，因而能使樣品中各組分得到分離。

HSCCC主要具有以下幾個方面的優(yōu)點(diǎn)。

2.2.1  應(yīng)用范圍廣，適應(yīng)性好。由于溶劑系統(tǒng)的組成與配比可以是無限多的，因而從理論上講HSCCC適用于任何極性范圍的樣品的分離，所以在分離天然化合物方面具有其獨(dú)到之處。并因不需固體載體，而消除了氣液色譜中由于使用載體而帶來的吸附現(xiàn)象，特別適用于分離極性物質(zhì)和其它具有生物活性的物質(zhì)。

2.2.2  操作簡便，容易掌握。分離過程中對樣品的前處理要求低，僅需一般的粗提物即可進(jìn)行HSCCC的制備分離或分析。

2.2.3  回收率高。由于沒有固體載體，不存在吸附、降解和污染，理論上樣品的回收率可達(dá)100％。在實(shí)驗(yàn)中只要調(diào)整好分離條件，一般都有很高的回收率。

2.2.4  重現(xiàn)性好。如果樣品不具有較強(qiáng)的表面活性作用，酸堿性也不強(qiáng)，那么多次進(jìn)樣，其分離過程穩(wěn)定性都保持很好、峰的保留相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也小于2%，重現(xiàn)性相當(dāng)好。

2.2.5  分離效率高，分離量較大。由于其與一般色譜的分離方式不同，能實(shí)現(xiàn)梯度操作和反相操作、亦能進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣，使其特別適用于制備性分離，產(chǎn)品純度高。研究結(jié)果表明:一臺普通的高速逆流色譜儀一次進(jìn)樣可達(dá)幾十毫升，一次可分離近10g的樣品。因此，在80年代后期被廣泛地應(yīng)用于植物化學(xué)成分的分離制備研究。

最初的高速逆流色譜儀只有一個分離柱，用配重平衡離心體系。最近的儀器在設(shè)計上有較大突破，采用多個分離柱，不用配重，性能和實(shí)用能力大大提高。目前高速逆流色譜儀有分析型和半制備、制備型三大系列，較大的制備型HSCCC，柱容積可達(dá)1000mL，一次最多進(jìn)樣可達(dá)20g粗品。不但適用于非極性化合物的分離，也適用于極性化合物的分離，對檢測器的靈敏度要求不高。在制備分離方面，可用于天然產(chǎn)物中各組分的分離，也可進(jìn)一步精制，甚至直接從粗提物一步純化到純品。

    正確地選擇溶劑體系是HSCCC分離成功的關(guān)鍵。通常所用的溶劑體系分為三類:親水體系，由極性小的非水相與水相組成，兩相極性相差很大；親油體系，由高極性的非水相與水相組成，兩相極性相差不大；還有一類處于兩者之間，為中間體系。選擇溶劑體系時遵循兩個原則^[6,9]：（1）溶劑體系的分層時間小于30S ；（2）目標(biāo)樣品的分配系數(shù)K接近于1，容量因子大于1.5。選擇的方法有三種：參考前人體系、薄層色譜、液相。正己烷／乙酸乙酯／正丁醇／甲醇/水和氯仿／甲醇／水是比較經(jīng)典的兩個體系。對于未知樣品混合物，推薦先采用正己烷／乙酸乙酯／甲醇/水(1∶1∶1∶1)或氯仿／甲醇/水(10∶3∶7)嘗試，再根據(jù)目標(biāo)組分的分配系數(shù)調(diào)整溶劑組成^[9]。如可用乙醇代替甲醇增加體系的疏水性；加入鹽(乙酸銨等)或酸(三氟乙酸或乙酸)增加體系親水性。有文獻(xiàn)報道：正丁醇／乙酸乙酯/水(3∶2∶5)適于分離極性大的物質(zhì)，而正庚醇／乙酸乙酯／甲醇/水(6∶1∶6∶1)適于分離弱極性和非極性物質(zhì)^[10]。

近年來，溶劑體系的選擇范圍越來越廣泛。有人用超臨界二氧化碳(SFCO₂)作流動相^[11]，利用SFCO₂高擴(kuò)散性、低粘度、流體特性、環(huán)境友好等優(yōu)勢^[12]。還有人用制冷劑R134a(1，1，1，2—tetrafluoroethane)作流動相。由于B134a這種流動相在常溫常壓下是氣體，不必再富集或蒸干溶劑收集，從而避免了純品的損失。有人提出當(dāng)了解兩相組成后，可以獨(dú)立配制上下兩相，避免溶劑的浪費(fèi)^[15]。

HSCCC使用的溶劑體系的組成是千變?nèi)f化的，各溶劑的性質(zhì)也各不相同，因而具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，為從復(fù)雜的天然產(chǎn)物中提取成分提供了有利條件。因此，國際上HSCCC被大量用于天然產(chǎn)物各類化學(xué)成分的分離純化，如生物堿、黃酮類、萜類、木脂素、香豆素類等，以下為一些成功應(yīng)用實(shí)例：

3.1.1  銀杏 Gingkgo biloba 

采用氯仿/甲醇/水（4:3:2）體系，可從銀杏葉粗提物中一次分離得到白果內(nèi)酯單體 ^[2]。（萜類）此外利用HSCCC與HPLC相結(jié)合，以水為固定相，乙酸乙酯為流動相，梯度增加異丁醇，至乙酸乙酯與異丁醇之比為（6:4），可一次分離出7個黃酮苷，純度達(dá)98%以上。（黃酮）

參照蔡定國等論述的沙棘黃酮成分分離條件，從銀杏葉浸膏水解物中分離得到異鼠李素、山奈酚和槲皮素，經(jīng)HPLC分析，純度達(dá)98%以上。（黃酮）

3.1.2  丹參 

Salvia miltiorrhiza  使用三種溶劑系統(tǒng)，經(jīng)HSCCC分極梯度洗脫，從丹參粗提物中一次分離純化得到丹參酮IIA(tonshinone II A ) ，丹參酮I（tanshinoneI），隱丹參酮(cryptotanshinone)^[3]。（蒽醌）

   采用正己烷/乙醚/甲醇/水（8/5/10/4）體系，上相為固定相，分離丹參乙醚提取物，用丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品對照，經(jīng)HPLC檢測，得到的丹參酮IIA純度達(dá)到99%。（蒽醌）

3.1.3  粉防己 

Stephania tetrandra  粉防己主要含生物堿類。用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（3:7:5:5）為溶劑系統(tǒng)，從粉防己干燥根提取物中分離了粉防己堿（tetrandrine）、去甲粉防己堿（fangchinoline）和輪環(huán)藤酚堿（cyclanoline）。（生物堿）

3.1.4  黃連 Cotis chinensis 主要含小檗堿等生物堿。利用制備型HSCCC從黃連根生物堿粗提物中分離純化得到巴馬亭（palmatine）、小檗堿（epiberberine）及黃連堿（coptisine）^[4]。（生物堿）

3.1.5  虎杖  

Polygonum cuspidatwn   含蒽醌類化合物等成分。分別用氯仿/甲醇/水（4:3:2）、乙酸乙酯/乙醇/水（10∶1∶10）溶劑體系，經(jīng)MS與1HNMR鑒定，從虎杖根的乙酸乙酯提取物及水提物中分離得白藜蘆醇（resveratrol）、虎杖甙（polydatin）單體 ^[5]。

3.1.6  葛 

Pueraria lobata  用乙酸乙酯/正丁醇/水（2:1:3）溶劑系統(tǒng)，可從葛根粗提物中一步分離得到包括葛根素（puerarin）在內(nèi)的七個異黃酮類化合物^[6]。（黃酮）

3.1.7  蘋果  Malus pumila 

蘋果皮含有色素類成分。以乙酸乙酯/水（1:1）為溶劑系統(tǒng)（上層為流動相），一次進(jìn)樣得到了聚合程度不同的原矢車菊素(procyanidin)；用正丁醇/乙酸乙酯/乙腈/0.1%三氟乙酸（2:4:3:8）溶劑系統(tǒng)細(xì)分得Procyanidin A及procyanidin B^[7]。

3.1.8  牛膝

Achyranthes bidentata  多糖類為牛膝活性成分之一。以12.5% PEG1000及65%磷酸鉀緩沖液組成的水性二相系統(tǒng)，在正交軸式HSCCC上，實(shí)現(xiàn)了牛膝多糖的分離和純化^[8]。(多糖)

3.1.9  寬葉羌活

Notopterygium forbessi  以石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水(比例從5:5:4.8:5至5:5:5:4)為溶劑系統(tǒng)，從中分離得到notopterol、isoimperatorin，純度在98％以上^[9]。

3.1.10  紅豆杉粗提物

采用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（2:5:2:5）及正己烷/氯仿/甲醇/水（5:25:34:20）為溶劑系統(tǒng)，分離純化得到10-脫乙酰漿果紫杉素（10-deacelylbaccatin），純度在98%以上^[10]。此外，分別用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（6:3:2:5）和正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（1:1:1:1）為溶劑系統(tǒng)，從粗提物中分離純化了三個結(jié)構(gòu)相似的紫杉烷類二萜化合物質(zhì)紫杉醇（taxel）、三尖杉寧堿（Cephalomannine）、漿果紫杉素（baccatin）。以石油醚（bp. 40～65ºC）/乙酸乙酯/甲醇/水（50:70:80:65）為兩相體系，從紫杉醇的混合物中分離得到了純的紫杉醇和三尖杉寧堿。

3.1.11  大黃

 Rheum  officinale 大黃含蒽醌類化合物，以氯仿/甲醇/水（6:3:2）為溶劑系統(tǒng)，從大黃根莖中分離出大黃素（aloe-emodin）、大黃酸（rhein）、大黃酚(chrysophanol)、和大黃素(cmodin)；用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（9:1:5:5）梯度洗脫，從掌葉大黃Rheun palmatum的根莖中也分離了大黃素甲醚、蘆薈大黃酸、大黃酸、大黃酚和大黃素，純度在98%以上^[11]。

3.1.12  鹽生肉蓯蓉

 以乙酸乙酯/正丁醇/乙醇/水（4:0.6:0.6:5，v/v）為溶劑系統(tǒng)，從鹽生肉蓯蓉提取物中分離得到phenylethanoid glycosides(PhGs)、acteoside、2`-acetylacteoside，純度在98%以上^[12]。

3.1.13  山茱萸  

以乙酸乙酯/正丁醇/水(5:1.8:6)及乙酸乙酯/乙醇/水(5:0.5:6)，從1g山茱萸果實(shí)的正丁醇提取物中分離得到60mg沒食子酸(gallic acid)，純度為97％^[13]。

3.1.14  積雪草 

Centella asiatica  主要含多種α-香樹脂醇型的三萜成分。以氯仿/甲醇/異丁醇/水(7:6:3:1)為溶劑系統(tǒng)，從積雪草的抽提物中分離純化得到結(jié)構(gòu)非常相似的兩種成分，積雪草苷（asiaticoside）和羥基積雪草甙(madecassoside)，它們僅在同一支鏈上有差別，前者是H，后者是OH。（萜類）

3.1.15  山楂

從山楂葉粗提物中分離金絲桃苷（hypericin）、槲皮素(quercetin)、蘆丁(rutin)、牡荊素(vitexin)、異牡荊素(isovitexvin)；另外以氯仿/甲醇/水(33:40:27)體系，利用梯度洗脫技術(shù)，從山楂黃酮粗提物中分離出槲皮素、四羥基黃酮和槲皮黃酮。

3.1.16  唐古特山莨菪

 Antsodus luridus 又稱塞莨菪，主要含生物堿類。用氯仿/磷酸鹽(0.07mol/L、pH6.4)(1:1)為溶劑系統(tǒng)，從唐古特山莨菪粗提物中分離出了山莨?fàn)I菪堿（anisodamine）、樟柳堿（anisodine）等4個生物堿。

3.1.17  葡萄 

Vitis vinifera  有人采用合適的溶劑系統(tǒng)，從葡萄皮及葡萄酒中分離出了各種色素，包括malvidin-3-glucoside(vitisin A、acetylvitisin A)、peonidin-3, 5-diglucosides、anthocyanins等^[14]。

3.1.18  茶  

以適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)從茶葉中分離純化了兒茶酚(catechins)、黃酮醇葡萄糖苷類(flavonol glycosides)、strictinin、proanthocyanidins，并經(jīng)1H NMR和HPLC-ESI-MS鑒定^[15]，此外還從紅茶中分離了茶黃素(theaflavine)、表茶黃酸（epitheaflavic acids）、thearubigins^[16 ]。

3.1.19  黃柏

 氯仿/甲醇/0.5mol/LHCl（2：1：1）體系，在不到2小時的時間內(nèi)，經(jīng)過TLC分析，一次分離得到6種單一的生物堿，一種含有兩個成分的生物堿，并檢出了小檗堿。

3.1.20  苦參

以氯仿/甲醇/NaH₂PO₄緩沖液（pH5.4）（27/20/13）為溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，從中藥苦參的總生物堿中共分得10個成分，其中9個與碘化鉍鉀試劑反應(yīng)生成桔紅色的化合物，并硅膠薄層板驗(yàn)證了分離效果，用MS證實(shí)了其中的苦參堿成分。

在考察NaH₂PO₄緩沖液的pH（5.4，5.1，5.5，5.9）對分離結(jié)果的影響時，發(fā)現(xiàn)pH5.4時分離效果，其余隨pH的增大或減少，會使峰形消失。

另有人從苦參總堿中分離了苦參堿和氧化苦參堿。

3.1.21   青葉膽（云南獐牙菜）

以氯仿/甲醇/NaH₂PO₄緩沖液（pH4.8）（3/2.5/1）為溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，從青葉膽總生物堿中分得5個成分，其中3個成分與碘化鉍鉀試劑反映顯桔紅色，用TLC驗(yàn)證了分離效果，并用紅外光譜法證實(shí)其中一個為龍膽堿。

3.1.22   中藥復(fù)方桂枝湯部分A 

證實(shí)其主要成分是生物堿，采用二氯化碳/四氯化碳/甲醇/水（10/4/7/4）上相做固定相，經(jīng)HPLC檢測，得到一純度98%以上的生物堿。

3.1.23  蘆薈 

以氯仿/甲醇/水（9/10.5/8）為溶劑體系，上相做固定相，從蘆薈生藥中一次性分離得到蘆薈甙（99.99%）和蘆薈大黃素（95.83%），分別達(dá)到定量和鑒別用化學(xué)對照品品要求。

3.1.24 洋地黃毒甙的純化

   采用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（6/3/2/5）體系，上相為固定相，經(jīng)過同體系兩次分離，對結(jié)構(gòu)不太穩(wěn)定的洋地黃毒甙，能的從含量72.5%提高到98.6%（HPLC、UV、IR）。在另外一次研究中，還成功分離純化了異羥基洋地黃毒甙。

3.1.25 鬼臼毒素的純化

用氯仿/甲醇/水（6.5/3.5/1）體系，下相做流動相，35min內(nèi)得到鬼臼毒素和4^/-去甲基鬼臼毒素的純品。

3.1.26  香芹菜

用正己烷一乙腈一叔丁基甲基醚(10：10：1)從香芹菜中分離falcarind和falcarindiel；還從香芹菜中分離得到了2個C₂₀化合物。

3.1.27小蔓長春花

用正己烷一乙醇一水(6：5：5)體系，從小蔓長春花植物的葉子中分離了長春胺和長春辛。

3.1.28委內(nèi)瑞拉箭毒

以正丁醇一丙酮一水[8：1：10]體系，用于從委內(nèi)瑞拉的箭毒中分離了馬枯素和Panarine。

3.1.29 洋金花總堿

從洋金花總堿中分離了莨菪堿、東莨菪堿及待定成分。

3.1.30蛾眉干里光

從蛾眉干里光粗堿中分離了金緣干里光堿、闊葉干里光堿和新闊葉干里光堿。

3.1.31三尖杉總堿

從三尖杉總堿中分離了異三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿。

3.1.32 芫花總黃酮

    用氯仿一甲醇一水(4：3：2)體系從芫花總黃酮中一次進(jìn)祥100mg分離得到了3^/羥基芫花素、洋芹素、木犀草素。

3.1.33大黃羥基蒽醌總甙元

從大黃羥基蒽醌總甙元中分離了大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚等。

3.1.34Epilobiumparviflorum(柳葉菜屬)

以兩相系統(tǒng)氯仿一甲酵一水(7：13：8)，從Epilobiumparviflorum(柳葉菜屬)的甲醇萃取物中分離得到了槲皮甙、楊梅甙、異楊梅甙和沒食子酸。

3.1.35 黃酮混合物

   以氯仿一甲醇一水(33：40：27)體系，在70min內(nèi)從黃酮混合物中分離出橙皮素，四羥基黃酮和槲皮黃酮，并地利用了梯度洗脫技術(shù)；利用氯仿一甲醇一水(4：3：2)的兩相系統(tǒng)對5個黃酮類化合物進(jìn)行了分離并進(jìn)行了定量分析。

3.1.36 Garcinia Kola(藤黃屬)

利用正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水(1：4：2．5：2．5)從Garcinia Kola(藤黃屬)種子中也分離出了多個雙黃酮。

3.1.37青蒿

以異辛烷一乙酸乙酯(7：3)為固定相，甲醇一水(6：4)作為流動相，從青蒿中純化出了Artemisinin；以異辛烷一甲醇一水(10：7：3)為固定相和流動相從青蒿中分離了epideox-yarteannuin。

3.1.38 Cochlospermum tinctorium(卷胚屬)

利用四氯化碳一甲醇一水(5：4：1)的溶劑系統(tǒng)，將Cochlospermum tinctorium(卷胚屬)的根的甲醇萃取物500mg溶解在10ml的1：1的兩相溶劑系統(tǒng)中一次進(jìn)樣得到純的cochloxan-thin和dihydrocochloxanthin。

3.1.39龍膽

以氯仿一甲醇一水(9：12：8)從龍膽的根的甲醇萃取物中分離得到了1個裂環(huán)烯醚萜甙。

3.1.40江花五味子

以正己烷一甲醇一水(6：5：5)的兩相系統(tǒng)在80 min內(nèi)從江花五味子果實(shí)的核的乙醇萃取物中分離了2個結(jié)構(gòu)十分相似的木脂素的成分一schisanhend和它的乙酸化物。

3.1.41人參

以氯仿一甲醇一水的溶劑系統(tǒng)從西伯利亞人參的根中分離得到了純的eleutheroside。

3.1.42香豆素混合物

用氯仿一甲醇一水(13：7：8)的兩相體系，分離并分析了香豆素混合物中甲醚散形酮、7-甲氧(基)香豆素、7—羥基—6—甲氧基香豆素和7—羥基香豆素。

3.1.43毛地黃皂甙

以氯仿一甲醇一乙酸—水(5：3：1：3)的兩相系統(tǒng)，從90mg的商品毛地黃皂甙中分離出幾個強(qiáng)心甙的化臺物。

 

    正丁醇一丙酮一水[8：1：10]曾用于從委內(nèi)瑞拉的箭毒中分離馬枯素和Panarine，樣品進(jìn)樣達(dá)700mg；正丁醇一氯化鈉[0.1mol/L]〔1：1〕的兩相溶劑體系用于從Strychnos Usambarensis(馬錢科)的樹干和村皮中分離10—經(jīng)基—Nb—甲基—柯楠醇；用四氯化碳一甲醇一水(20：20：2)從Aniso—cycla cymosa的根中分離得到了一個季銨鹽生物堿和5個叔芐基異喹啉生物堿，用正己院一乙酸乙脂一甲醇一水(3：7：5：5)在70min內(nèi)以1800r／min的轉(zhuǎn)速從粉防已干根的提取物中分離了粉防己堿、去甲粉防己堿和輪環(huán)藤酚堿；從唐古持山莨菪粗提物中，用氯仿一磷酸鹽[0.07mol/L、pH 6．4](1：1)的系統(tǒng)分離出了4個生物堿；從小蔓長春花植物的葉子中用正己烷一乙醇一水(6：5：5)體系分離長春胺和長春辛；將HSCCC與Ms聯(lián)用分析長春胺和長春辛堿。分別用正己烷一乙酸乙脂一乙醇一水(6：3：2：5)和正己烷一乙酸乙脂一甲醇一水(1：1：1：1)從紅豆衫的粗提物中分離純化了紫杉醇、

cephalomannine、巴卡亭Ⅱ，以石油醚(bp，40一65℃)一乙酸乙脂一甲醇一水(50：70：80：65)為兩相體系從紫杉醇的混合物中分離得到了純的紫杉醇和cephalomannine。

有學(xué)者對粉防己的粗提物也進(jìn)行了分離；從苦參總堿中分離了苦參堿和氧化苦參堿。從洋金花總堿中分離了莨菪堿、東莨菪堿及待定成分；從蛾眉干里光粗堿中分離了金緣干里光堿、闊葉干里光堿和新闊葉干里光堿；從三尖杉總堿中分離異三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿。

氯仿一甲醇一水(5：4：3)體系曾用于感染了枝頂孢屬內(nèi)部寄生菌的睡眠草，分離得到了麥角生物堿。Ito于1994年用新型的pH區(qū)帶提取ccc技術(shù)從Crinum moores的抽取物中進(jìn)祥3g得到了3個純的生物堿，此技術(shù)是HSCCC的一個較大的突破，它使植物的分離提取每次很方便地就達(dá)到了克量級。

用氯仿一甲醇一水(4：3：2)體系曾從芫花總黃酮中一次進(jìn)祥100mg分離得到了3^/羥基芫花素、洋芹素、木犀草素；氯仿一甲醇一水(6：3：2)以1800r／min的轉(zhuǎn)速在15min內(nèi)從大黃根莖中分離出大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素；從山楂葉粗提物中分離金絲桃甙、槲皮素、蘆丁、牡荊素、異牡荊素；以氯仿一甲醇一水(33：40：27)體系，700r／min轉(zhuǎn)速，在70min內(nèi)從黃酮混合物中分離出橙皮素，四羥基黃酮和槲皮黃酮，并地利用了梯度洗脫技術(shù)；Vanhaelen等將HSCCC與HPLC相結(jié)合從500mg的Ginkgo biloba(銀杏屬)的葉子萃取物中一次分離出了7個黃酮甙，其以水為固定相，開始以乙酸乙酯為流動相，然后在流動相中逐漸添加異丁醇,到分離結(jié)束時乙酸乙酯與異丁醇之比為(6：4)；Oka等以氯仿一甲醇一水(4：3：2)的體系在3500r／min下在8min內(nèi)從See buckthourn的果實(shí)萃取物中分離得到了5個主成分,其分離速度可與HPLC相比較；還有學(xué)者也從大黃羥基蒽醌總甙元中分離了大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚等；用正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水(9：1：5：5)在1800r／min轉(zhuǎn)速下在70min內(nèi)從掌葉大黃的根莖中分離出大黃素甲醚、蘆薈大黃酸、大黃酸、大黃酚和大黃素；將Epilobiumparviflorum(柳葉菜屬)的甲醇萃取物進(jìn)樣2g分離得到了槲皮甙、楊梅甙、異楊梅甙和沒食子酸，兩相系統(tǒng)為氯仿一甲酵一水(7：13：8)。

   Chenl992年利用氯仿一甲醇一水(4：3：2)的兩相系統(tǒng)對5個黃酮類化合物進(jìn)行了分離并進(jìn)行了定量分析，Kapadial994年利用正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水(1：4：2．5：2．5)從Garcinia Kola(藤黃屬)種子中也分離出了多個雙黃酮。

 C 萜類

    萜類是具有(C₅H₈)_n通式的天然化合物，以及含氧及飽和程度不等的衍人物。Wallach曾提出異戊二烯法則，根據(jù)分子中可分異戊二烯的多少分別稱為單萜、倍半萜、二萜、三萜等，植物中存在的橡膠、某些色素、揮發(fā)油、樹脂、苦味素等類型成分，大多屬于萜類或含有萜類成分。

從青蒿中純化出了Artemisinin，實(shí)驗(yàn)以異辛烷一乙酸乙酯(7：3)為固定相，甲醇一水(6：4)作為流動相；以異辛烷一甲醇一水(10：7：3)為固定相和流動相從青蒿中分離了epideox-yarteannuin;利用四氯化碳一甲醇一水(5：4：1)的溶劑系統(tǒng)以800r／min的轉(zhuǎn)速，將Cochlospermum tinctorium(卷胚屬)的根的甲醇萃取物500mg溶解在10ml的1：1的兩相溶劑系統(tǒng)中一次進(jìn)樣得到純的cochloxan-thin和dihydrocochloxanthin；以氯仿一甲醇一水(9：12：8)從龍膽的根的甲醇萃取物中分離得到了1個裂環(huán)烯醚萜甙，從Halenia campanu-lata中分離得到了2個裂環(huán)烯醚萜甙類，以氯仿一甲醇一水(7：13：8)從Abrus fruticulosus的葉中分離出了4個甜味三萜甙；從非洲植物Sesamum alat um中分離出了18，l 9-secoursane clisaccharide，兩相系統(tǒng)為氯仿一甲醇一戊醇-2—水(5：6：1：4)；用氯仿一甲醇—異丁醇一水（7：6：3：1）的系統(tǒng)從積雪草的抽提物中分離了2個結(jié)構(gòu)非常相似的皂角甙，1個是積雪草甙、1個是madecassoside，它們僅在同一支鏈上前者是H，后者是OH 。

 D 木脂素

Marrston等以1g的進(jìn)樣較大范圍地分離制備了肉掛酸、阿魏酸和咖啡酸，采用的溶劑系統(tǒng)為正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水(3：7：5：5)，轉(zhuǎn)速700r／min。

以正己烷一甲醇一水(6：5：5)的兩相系統(tǒng)以1500r／min的轉(zhuǎn)速在80 min內(nèi)曾從江花五味子果實(shí)的核的乙醇萃取物中分離了2個結(jié)構(gòu)十分相似的木脂素的成分一schisanhend和它的乙酸化物，以氯仿一甲醇一水的溶劑系統(tǒng)從西伯利亞人參的根中分離得到了純的eleutheroside。

Nitao等于1991年用正己烷一乙腈一乙酸乙酯一水(8：7：5：1)的兩相系統(tǒng)從Magno1ia virginian中進(jìn)行neelignans的最初純化，它比傳統(tǒng)的柱色譜更快、更、更經(jīng)濟(jì)。

用氯仿-甲醇一水（13：23：16）的兩相系統(tǒng)一次進(jìn)樣140mg來自于Lomatium dissectum的樣品得到了3個香豆素的甙和1個黃酮甙；用氯仿一甲醇一水(13：7：8)的兩相體系分離并分析了香豆素混合物中甲醚散形酮、7-甲氧(基)香豆素、7—羥基—6—甲氧基香豆素和7—羥基香豆素；俞維樂等從Artemisia dalailamae kraschen中以氯仿一甲醇一水(2：1：1)分離出了純的7—羥基—6—甲氧基香豆素以及isofraxdin和taxaxery1-acetate，達(dá)到了很好的分離效果。

    以氯仿一甲醇一乙酸—水(5：3：1：3)的兩相系統(tǒng)，以800r／min的轉(zhuǎn)速從90mg的商品毛地黃皂甙中分離出了幾個強(qiáng)心甙的化臺物；用HSCCC分離鞣酸；用正己烷一乙腈一叔丁基甲基醚(10：10：1)從香芹菜中分離falcarind和falcarindiel；還從香芹菜中分離得到了2個C₂₀化合物。

HSCCC使用的溶劑體系的組成是千變?nèi)f化的，各溶劑的性質(zhì)也各不相同，因而具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，為從復(fù)雜的天然產(chǎn)物中提取成分提供了有利條件。因此，國際上HSCCC被大量用于天然產(chǎn)物各類化學(xué)成分的分離純化，如生物堿、黃酮類、萜類、木脂素、香豆素類等，以下為一些成功應(yīng)用實(shí)例：

 

    液-液分配的技術(shù)特別適合于抗生素的分離，HSCCC的應(yīng)用也是最早從抗生素的分離開始的。采用疏水性體系，HSCCC能很好的分離抗生素混合物，例如：用苯／氯仿／甲醇／水(15∶15∶23∶7)分離依羅霉素(efortomycin)混合物^[9]；用乙醚/正己烷/甲醇/水（5∶1∶4∶5）分離放線菌素（actinomycin）混合物^[9]；用氯仿/甲醇/水（4∶4∶3）體系分離殺念菌素（candicidin）衍生物^[9]；四氯化碳/甲醇/0.01mol/L磷酸鉀緩沖液（ pH=7）(2:3:2)分離伊維菌素（ivermectin）^[9]；用氯仿/乙酸乙酯/甲醇/水（3∶1∶3∶2）分離普那霉素（pristinamycins）^[9]等等。

    最早人們用HSCCC分離一些小分子的肽，如：用氯仿／苯／甲醇／水(15∶15∶23∶7)分離短桿菌肽等等，隨著雙水相體系引入到HSCCC中，HSCCC開始應(yīng)用到分離大分子蛋白。雙水相分離的液-液分配原理，與高速逆流色譜有共性。但人們發(fā)現(xiàn)在行星平行軸式HSCCC上，雙水相體系很難保留，也難以讓雙水相保持分層。隨著正交軸式的HSCCC的發(fā)明，較好解決了平行軸式HSCCC的難題，但正交軸式的儀器，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難技術(shù)實(shí)現(xiàn)。最近深圳市同田生化技術(shù)有限公司在平行軸式HSCCC上做了一些關(guān)鍵技術(shù)的改進(jìn)解決了雙水相在平行軸儀器上保留難及不易分層的難題，此時雙水相體系保留可達(dá)70%以上。這樣就使大分子蛋白分離成為了可能。

    HSCCC應(yīng)用于食品分離的最大優(yōu)勢是粗品或復(fù)雜樣品可直接進(jìn)樣，一般用于食品除毒去雜或制備生物活性物質(zhì)。例如用HSCCC檢測食品中的毒素含量，分離SEA(導(dǎo)致食品污染的常見毒素)^[28]；用正已烷／乙腈／叔丁基甲基醚(10∶10∶1)從香芹菜中分離falcarind和falcarindiel ^[29]；糖和PNP衍生物用HSCCC正交螺旋管行星式離心分離，溶劑體系是正丁醇／乙酸／水(4∶1∶5)或正丁醇／甲醇／水(4∶1∶4).分離體系通過衍生可以增加分子的疏水性，從而用HSCCC實(shí)現(xiàn)分離^[30]。

    HSCCC在分離無機(jī)物方面的應(yīng)用主要集中于稀土元素或重金屬元素。例如用混溶的0.5mol/LDEPHA (二乙基已基磷酸鹽)和十二烷作固定相，鹽酸作流動相，富集稀有元素^[31]；用鹽酸和氯仿(溶有0.15mol/L  DEPHA)(1:1)溶劑體系分離鑭系元素Sm、Gd、Tb、Dy、Er、Yb，效果良好^[32]；用EHPA(乙基已基磷酸鹽)和單-2-乙基已基醚的甲苯溶液體系作固定相^[33]，含有鑭系元家如鈥和鉺的溶液(相當(dāng)于流動相)從上洗脫，在固定相中金屬元素富集，并發(fā)現(xiàn)了稀有元素的復(fù)合物的保留值與流動相的pH有較大關(guān)系， pH升高，保留體積提高，但是理論塔板數(shù)下降，另外，在流動相中加入銨鹽并不影響固定相保留值。根據(jù)上述方法，HSCCC可用于環(huán)境分析檢測或控制污染。雖然靈敏度較低，但是固定相能夠富集干擾的金屬離子^[34]。

隨著技術(shù)的發(fā)展，HSCCC應(yīng)用范圍逐步拓展。已經(jīng)有人嘗試用HSCCC拆分消旋化合物^[35]。例如N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺，成功地用于氨基酸的衍生物的分離^[36]。有人用HSCCC分離紫膠染料，溶劑體系是叔丁基甲基醚／正丁醇／乙醇/水(2∶2∶1∶5)，得到的物質(zhì)純度在95％左右^[37]。Ma和Ito發(fā)現(xiàn)增加有機(jī)固定相中手性選擇性試劑的含量及增大溶劑系統(tǒng)的疏水性可提高色譜峰的分辨率。

目前HSCCC多采用紫外檢測器進(jìn)行在線檢測，但HSCCC選用的有機(jī)溶劑及所分離的組分，有很多不適合用紫外檢測，因而大家把目光投向了各種檢測器與HSCCC聯(lián)用技術(shù)上來。分流器技術(shù)的使用，解決了HSCCC與各種檢測器聯(lián)用的接口問題，目前已有HSCCC與質(zhì)譜（MS）、紅外（FTIR）、蒸發(fā)光散射（ELSD）聯(lián)用的應(yīng)用，從而為HSCCC的應(yīng)用提供了一種新型多維分離分析方法。Rinehart等報道了HSCCC與電噴霧質(zhì)譜（ESIMS）聯(lián)用技術(shù)^[4]，并評價了色譜分離和質(zhì)譜分析的表現(xiàn)，認(rèn)為制備型逆流色譜更適合于天然產(chǎn)物的分離分析。

近兩年，國外有人成功的將HSCCC與ELSD聯(lián)用，分離了7-甲氧基香豆素、橙皮素、莨菪亭、微形酮，效果非常好。深圳市同田生化技術(shù)有限公司應(yīng)用HSCCC與ELSD聯(lián)用，分流收集，成功的制備分離了銀杏中四個內(nèi)酯單體，并將之產(chǎn)業(yè)化。

總之，各種檢測器的優(yōu)點(diǎn)與HSCCC技術(shù)的良好地結(jié)合，為逆流色譜技術(shù)的應(yīng)用開創(chuàng)了一個廣闊的局面。

雙向逆流色譜^[7]（dual-mode countercurrent chromatography,簡稱DuCCC），即兩相分別從螺旋管兩端同時流入，又從相對應(yīng)的端口同時流出，兩相形成真正的逆向?qū)α�。與常規(guī)的HSCCC相比，DuCCC分離速度更快，分離效率更高，不必預(yù)測溶質(zhì)的保留時間和分配系數(shù)，減少了溶劑選擇的繁瑣。該項(xiàng)技術(shù)可應(yīng)用在蛋白分離。

4.3 利用HSCCC建立中藥指紋圖譜   

中藥質(zhì)量可控是中藥現(xiàn)代化的一個重要內(nèi)容，中藥以及復(fù)方因其復(fù)雜的成分和未明的作用機(jī)理，阻礙著中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程。中藥指紋圖譜技術(shù)已成為研究中藥成分及作用機(jī)理，控制中藥質(zhì)量，推動中藥業(yè)走向世界的關(guān)鍵技術(shù)。HSCCC具有很好的分辨率和重現(xiàn)性，加上不存在固體載體吸咐，對樣品的前處理要求不高或不用前處理，不存在分離過程丟失成分和成分變性的問題，因而可用于中藥成分的定性或半定量分析，并整理出中藥材的特征峰和指紋譜，制定標(biāo)準(zhǔn)圖譜，用于中藥的質(zhì)量控制和測定。在高速逆流色譜指紋圖譜研究方面，目前已對大黃、沙棘、何首烏等一些中藥進(jìn)行了研究^[10]。

逆流色譜無需固體載體，能實(shí)現(xiàn)連續(xù)分離，有多種多樣的溶劑系統(tǒng)可采用；不但適用于非極性化合物，而且適用于極性化合物的分離；能實(shí)現(xiàn)從上百毫克量到數(shù)克的制備提純；它可用于天然產(chǎn)物粗提物的去除雜質(zhì)，也可用于產(chǎn)物的精制，甚至直接從粗提物進(jìn)一步純化到達(dá)純品；也能與質(zhì)譜儀或紅外光譜儀、蒸發(fā)光散射儀等聯(lián)用，應(yīng)用前景十分廣闊。隨著HSCCC技術(shù)的迅猛發(fā)展，逆流色譜將在分離制備方面發(fā)揮越來越重要的作用。

 

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