制備色譜技術(shù)與操作
1 制備色譜到底是什么？請(qǐng)介紹一下制備色譜？
有些搞分析色譜的朋友，對(duì)制備色譜這個(gè)名詞比較陌生。其實(shí)，在化學(xué)化工醫(yī)藥等廣泛采用的層析法以及薄層色譜就是最為典型的制備色譜。下面對(duì)制備色譜中的一些常用概念做一下介紹。
（1）分析色譜的目的，是分析出混合物中一個(gè)（或者幾個(gè)）純物質(zhì)的含量。制備色譜的目的，是從混合物中得到純物質(zhì)。為了加快分離的時(shí)間與提高分離的效率，制備色譜的的進(jìn)樣品量很大，導(dǎo)致制備色譜柱子的分離負(fù)荷的相應(yīng)加大，也就必須加大色譜柱填料，增大制備色譜的直徑和長(zhǎng)度，使用的相對(duì)多的流動(dòng)相。然而，當(dāng)色譜柱上樣品負(fù)載加大的時(shí)候，往往導(dǎo)致柱效急劇下降而得不到純的產(chǎn)品。制備色譜，要解決容量與柱子效果之間的矛盾，對(duì)重現(xiàn)性也要考慮。從經(jīng)濟(jì)上來(lái)說(shuō)。制備色譜要爭(zhēng)取少用填料，少用溶劑，要盡可能多的得到產(chǎn)品。
（2）樣品的前處理： 制備色譜柱子由于處理的樣品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前處理就顯得非常的必要。萃取、過(guò)濾、結(jié)晶、固相萃取等簡(jiǎn)單的分離方法，如果用得上，而且還不是很麻煩，就要盡可能多的采用以去掉雜質(zhì)。
（3）制備色譜柱的材質(zhì)及其特點(diǎn)
下面介紹一下，制備色譜柱常用的材質(zhì)及其特點(diǎn)。
各種規(guī)格的玻璃柱子在實(shí)驗(yàn)室里頭很容易得到，而且價(jià)格低廉，但玻璃柱子致命的弱點(diǎn)是它能承受的壓力很小，且非常容易破碎。當(dāng)由于壓力太小而導(dǎo)致流動(dòng)相流速很慢的時(shí)候，高位液面或加高壓空氣（或者氮?dú)猓┑牟捎檬且粋�(gè)簡(jiǎn)單的解決辦法。在底下加真空，也能在一定程度上解決這個(gè)問(wèn)題。不銹鋼柱子具有良好的耐腐蝕、抗壓力性能，但其價(jià)格相對(duì)很貴。如果，只有很小的分離任務(wù)且經(jīng)費(fèi)也允許，市面上直徑為1cm的小型制備柱就是。有機(jī)玻璃柱子也能抗壓力耐腐蝕，相對(duì)不銹鋼柱子而言，它是半透明的，可以看到液體的運(yùn)行狀態(tài)，對(duì)有色的物質(zhì)其特點(diǎn)就更為突出。
（4）固定相的選擇 硅膠、鍵合固定相（如C18）、離子交換樹(shù)脂 、聚酰胺、 氧化鋁、 凝膠等都可以作為色譜柱的填料。 有不少文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)填料可以進(jìn)行一下處理提高了分離效果，如，對(duì)硅膠進(jìn)行的硝酸銀（或緩沖液）處理。
（5）裝柱方法的選擇 根據(jù)固定相顆粒度和柱子的尺寸，采用不同的裝柱方法，往往裝填越好分離效果越好。裝柱效果跟填料的顆粒度關(guān)系很大，顆粒度的減少會(huì)導(dǎo)致裝柱的難度。一般來(lái)說(shuō)，顆粒直徑小于20－30um的固定相采用濕法裝填。所謂“敲擊－裝填”技術(shù)適用于顆粒直徑大于25um的固定相。濕法的目的是迫使相對(duì)稀松的 固定相懸漿以高速裝入色譜柱子，從而減少空隙的形成。然而，當(dāng)柱直徑大于20mm，所加壓力為30－40bar時(shí)，高壓懸漿裝填技術(shù)就變得十分復(fù)雜。為將小顆粒固定相裝入更大得制備型色譜柱，可采用柱長(zhǎng)壓縮技術(shù)。這種方法，先將固定相懸漿（或偶爾是干填充物）裝入柱中加壓，利用物理方法將其壓緊。壓緊的方法有兩種：徑向壓縮和軸向壓縮。 濕法裝柱需要一定的設(shè)備，在柱子填完后，應(yīng)用有柱效的測(cè)量，對(duì)柱效低的柱子應(yīng)該重填。
（6）流動(dòng)相的選擇 除了和分析色譜同樣的考慮外，在選用流動(dòng)相時(shí)，要考慮色譜分離后面加有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等二次分離操作。一般來(lái)說(shuō)，不宜采用高毒性溶劑，對(duì)多元溶劑要盡可能的少用。
如果產(chǎn)品中含有大量溶劑，溶劑的純度也要考慮在其中。
（7）加樣的方法 可以采用以下方法之一進(jìn)樣。－用注射器進(jìn)樣－用旋轉(zhuǎn)閥進(jìn)樣－通過(guò)六通閥進(jìn)樣－通過(guò)主泵進(jìn)樣－通過(guò)輔泵進(jìn)樣－固體上樣
（8） 泵的選用 生產(chǎn)制備色譜泵的廠商很多。根據(jù)有無(wú)脈沖、能承受的最大壓力、控制的精度、售后服務(wù)等來(lái)選擇泵。
（9）檢測(cè)器的選用 一般的分析池的最大允許流速僅為5 mL/min 或者10mL/min。而專門(mén)的制備池的最大允許流速可為150mL/min。有時(shí)，采用旁路分離管，將少量流體導(dǎo)入分析池進(jìn)行檢測(cè)，是一個(gè)不錯(cuò)的辦法，但其濃度的誤差會(huì)相對(duì)較大。
（10）組分保留時(shí)間的估計(jì) 用分析柱子在同等色譜條件下（同樣的固定相和流動(dòng)相）測(cè)定保留時(shí)間后，按照單一組分的線流速（不是體積流速）一定，通過(guò)計(jì)算可以知道組分的大致保留時(shí)間區(qū)域。
分析譜圖的峰形狀，對(duì)確定保留時(shí)間也有很大的參考價(jià)值。
（11）產(chǎn)品的收集 手工餾分收集費(fèi)時(shí)費(fèi)力，自動(dòng)餾分收集器有很大的方便。許多實(shí)驗(yàn)室和工廠都采用了餾分收集器。
（12）超載、邊緣切割、中心切割、放大技術(shù)與非線性效用 在制備色譜中，因?yàn)闆](méi)有必要達(dá)到分析色譜那樣的分離度，可以在一定范圍內(nèi)大大加大進(jìn)樣的濃度和體積。在做分離的時(shí)候，也有一些分析色譜的時(shí)候，不能用到的技巧。因?yàn)槠P(guān)系，不在這里敘述。
（13）柱轉(zhuǎn)換技術(shù) 通過(guò)接頭或者閥門(mén)，實(shí)現(xiàn)柱子的簡(jiǎn)單延長(zhǎng)，或者比較方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)其中一個(gè)（或幾個(gè)）組分的精制。
（14）比較新的制備色譜技術(shù) 模擬移動(dòng)床可以連續(xù)進(jìn)樣，并可以利用邊緣切割效用，而且采用了柱切換技術(shù)，能更好的利用溶劑和填料，已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。其理論和技術(shù)也日益完善。
迎頭色譜、超臨界流體色譜、逆流色譜環(huán)形色譜、氣相制備色譜等在科研和工業(yè)生產(chǎn)中也得到了應(yīng)用。
問(wèn): 我想購(gòu)買(mǎi)waters600用于分析和制備，對(duì)于其配備有什么好的建議。
可以配一個(gè)PDA，另外加一個(gè)示差折光410，另外買(mǎi)幾根制備柱就可以了。
waters600的流速最大為20mL/min，一般可以配20mm ID的制備柱，一次分離10-100mg的樣品，如果樣品量更大，可以通過(guò)配件擴(kuò)展到45mL/min，使用30mm ID的制備柱。另外為了餾分收集的性，配上Fraction II 餾分收集器。
如果樣品數(shù)量很大，可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同時(shí)做自動(dòng)進(jìn)樣并通過(guò)MS或UV信號(hào)自動(dòng)收集餾分。這樣可以過(guò)夜自動(dòng)運(yùn)行。最大通量每天可以處理100-200個(gè)樣品。
2 問(wèn)： 如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？
制備色譜柱為Zorbax SB-C18 9.4＊250mm及gilson餾分收集器，色譜儀為Agilent 1100或LC-6A。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進(jìn)行定性分析。如何設(shè)定色譜條件，如流量，進(jìn)樣量，樣品的濃度，切割點(diǎn)的設(shè)置，是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除。（主峰后有二個(gè)雜質(zhì)離得很近。）
1 制備用的流動(dòng)相等級(jí)高一點(diǎn)，否則流動(dòng)相中的雜質(zhì)會(huì)影響LC-MS分析。
2 使用餾分收集器時(shí)，延遲體積一定要計(jì)算精確，檢測(cè)器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)到最小，否則都會(huì)影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min，9.4mm制備柱用1＊（9.4/4.6）2, 大約為4ml/min。進(jìn)樣量設(shè)到幾個(gè)mg應(yīng)該基本沒(méi)有過(guò)載。進(jìn)樣樣品濃度越高越好。假如進(jìn)樣10mg，理論計(jì)算0.05%的雜質(zhì)大約只有5ug，顯然濃度太低，是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。
3 問(wèn)： 我想用hplc分離一個(gè)簡(jiǎn)單的多肽,我應(yīng)該選用什么樣的流動(dòng)相,還有他的梯度,還有選用什么樣的柱子
RP-HPLC,C18柱可以制備很少量的肽。如果用RP-HPLC，首先應(yīng)該用同類型的分析柱子分析一下多肽含多少雜質(zhì)，設(shè)置緩緩的梯度的分離樣品，在根據(jù)分析柱子跑出的峰形，逐漸放大純化的方法。
4 問(wèn)：TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)pH的作用呢？TFA的濃度越高基線的漂移越厲害，那是不是說(shuō)它的濃度在緩沖液pH允許的情況下越低越好呢？
（1）TFA起到類似離子對(duì)的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過(guò)高的濃度，會(huì)使溶液偏酸，長(zhǎng)時(shí)間使用可能影響柱子壽命。
（2）同時(shí)TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時(shí)0.1%TFA分離不好的話�？梢钥紤]加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時(shí)沖洗色譜柱。
（3）走梯度時(shí)，因?yàn)樽叱苫�漂移，但對(duì)制備的影響不大。
5 問(wèn)：樣品如果溶解度太低如何上制備HPLC？
（1） 了解一下樣品的性質(zhì),根據(jù)其酸堿性,極性等性質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)溶劑的pH值等, 以達(dá)到較好的溶解度。
（2）樣品可能某種晶型難溶，這樣可以加入其他溶劑（如丙酮等）以助溶。
（3）不是一定要用流動(dòng)相來(lái)溶解樣品，對(duì)溶解度差的樣品，可以選擇甲醇，THF或DMSO等溶解樣品。特別是DMSO，對(duì)一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不會(huì)造成干擾。而且DMSO的洗脫能力很弱，一般不會(huì)影響峰型。
（4） 可以固體上樣。
6 問(wèn)：多肽的分離制備, 如何上量？如何增大分離度?
反相HPLC應(yīng)當(dāng)是很好的分離小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流動(dòng)相，看保留如何，若無(wú)保留，建議改用其他色譜方法進(jìn)行分離。
關(guān)于多肽的分離，首先要知道它的分子量大小，然后選擇不同類型的填料，如孔徑的大小。我們先在分析柱（4.6MM內(nèi)徑）上做一下實(shí)驗(yàn),找到最大的分離度,這一過(guò)程的難度是最大的,要不斷地改變流動(dòng)相和固定相,然后再線性或非線性放大到制備,放大的倍數(shù)按分析柱的實(shí)驗(yàn)。
