學(xué)習(xí)目的與要求：
1、了解色譜分離技術(shù)的概念、分離工作原理
2、掌握各種色譜分離技術(shù)的主要操作步驟
重點(diǎn)與難點(diǎn)：
掌握幾種色譜分離技術(shù)的主要操作步驟
教學(xué)方法：多媒體
一、色譜技術(shù)的概念
概念：色譜技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱，色譜柱的一般結(jié)構(gòu)含有固定相（多孔介質(zhì)）和流動(dòng)相，根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配行為不同（由于親和力差異），經(jīng)過(guò)多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），達(dá)到分離的目的。
簡(jiǎn)單的說(shuō)，色譜技術(shù)是在特定的色譜柱當(dāng)中，利用不同物質(zhì)與固定相的親和力差異而實(shí)現(xiàn)分離的一組技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是分辨率高，是生化產(chǎn)品純化、分析的重要手段，這一切均源于其特殊的分離模式，即塔板理論
二、色譜分離方法的分類
色譜分離方法很多，種類有四、五十種。但常用于生物大分子分離的色譜方法，按機(jī)理分，有以下幾種：
1、吸附色譜
2、分配色譜
3、離子交換色譜
4、凝膠色譜
三、吸附色譜
1、原理：利用溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力（范德華力，包括色散力、誘導(dǎo)力、定向力以及氫鍵）的差異而實(shí)現(xiàn)分離
2、關(guān)鍵要素：吸附劑（固定相）和展開(kāi)劑（流動(dòng)相）的選擇
3、吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺等，均含有不飽和的氧原子或氮原子以及能夠形成氫鍵的基團(tuán)，如-OH和-NH2
4、常用的吸附劑：
氧化鋁、硅膠、活性炭、纖維素、聚酰胺、硅藻土
5、展開(kāi)劑的選擇
展開(kāi)劑極性越大，對(duì)同一化合物的洗脫能力越大
因此，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整展開(kāi)劑的極性以獲得最佳的分離的效果
展開(kāi)劑選擇的原則：
（1）對(duì)被分離組分應(yīng)具有一定的解吸附能力，極性應(yīng)比被分離物質(zhì)的極性略小
（2）展開(kāi)劑應(yīng)對(duì)被分離物質(zhì)具有一定的溶解能力
6、吸附色譜的操作程序
（1）根據(jù)要分離組分的性質(zhì)（包括極性、分子量、分子結(jié)構(gòu)）選擇合適的固定相和流動(dòng)相
（2）吸附操作：選擇合適的操作條件（溫度、pH值、流速），進(jìn)行裝柱、平衡、上樣，測(cè)定穿透樣品含量以調(diào)整操作參數(shù)
（3）洗脫：采用有機(jī)溶劑洗滌、調(diào)節(jié)pH值以及體系離子強(qiáng)度，最大限度地回收目標(biāo)產(chǎn)物
四、分配色譜
1、原理：利用溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法
2、構(gòu)成要素：固定相、載體、流動(dòng)相
載體：通常為惰性材料，能吸附固定相液體
載體種類：
硅膠、硅藻土、纖維素、葡聚糖凝膠
固定相：通常選取各組分溶解度大的溶劑作為固定相
流動(dòng)相可以是極性的（反相色譜法），也可以是非極性的（正相色譜）
*反相色譜 固定相是非極性的流動(dòng)相是極性的
3、高效液相（HPLC）
是一種典型的分配色譜，它是基于化合物在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的差異而實(shí)現(xiàn)分離的，由于經(jīng)過(guò)了多次的吸附－解析－吸附的過(guò)程，其理論塔板數(shù)可高達(dá)數(shù)萬(wàn)（分析性HPLC）

4、反相液相色譜
反相液相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)使基于蛋白質(zhì)的疏水性，因此通常采用非極性的烷基固定相作為填料，其表面化學(xué)性質(zhì)和流動(dòng)相的選擇應(yīng)最大限度地滿足疏水的要求
載體：微粒多孔硅膠（粒徑5μm~20μm ）
Hypersil?? Spherosil XOB075
固定相：C18、C8烷基鏈，C8適于分離蛋白質(zhì)
C18適于分離核酸
苯基
流動(dòng)相的選擇
通常采用有機(jī)溶劑，乙腈、異丙醇、正丙醇和四氫呋喃

五、離子交換色譜
1、概念：以離子交換樹(shù)脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動(dòng)相，使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法
2、常用的離子交換樹(shù)脂
（1）葡聚糖凝膠型?
DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25
（2）纖維素系列離子交換劑
DEAE-Sephacel? Cellex系列?
（3）瓊脂糖系列離子交換劑
Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow
Bio-Gel A 系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑
（4）Source 系列離子交換劑
特點(diǎn)：介質(zhì)均勻、分辨率高、流速快、反壓低
陽(yáng)離子交換樹(shù)脂? S系列
陰離子交換樹(shù)脂? Q系列
（5）MonoBeads 系列離子交換劑
特點(diǎn)：介質(zhì)為親水性聚醚，具有和Source系列相同的優(yōu)點(diǎn)，但動(dòng)態(tài)載量更大，壽命更長(zhǎng)。
同樣分為Q系列和P系列
六、凝膠色譜（, GPC）
1、概念：在樣品通過(guò)一定孔徑的凝膠固定相時(shí)，由于流經(jīng)體積的不同，使不同相對(duì)分子量的組分得以分離
2、特點(diǎn)：
操作簡(jiǎn)便
分離效果好，重復(fù)性高，回收率高
分離條件溫和
應(yīng)用廣泛 適用于生物大分子的初級(jí)分離，脫鹽
分辨率低

3、分子篩凝膠色譜原理
不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng)GPC柱時(shí)，不同分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以進(jìn)入凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過(guò)，保留時(shí)間短；而小分子恰恰相反，保留時(shí)間較長(zhǎng)）而得以分離（如上圖所示）
七、疏水作用層析

由于不同蛋白質(zhì)分子氨基酸組成差異，其疏水性也不盡相同，HIC技術(shù)是基于生物大分子的疏水性差異而實(shí)現(xiàn)分離的，該方法彌補(bǔ)了HPLC難以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離的不足。具體方法是：
在高鹽環(huán)境下，蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域暴露，固定相表面修飾了一些疏水的基團(tuán)，這樣蛋白質(zhì)的疏水部分即可與固定相發(fā)生較強(qiáng)的疏水相互作用，從而被結(jié)合在固定相表面，而一旦降低流動(dòng)相的鹽濃度即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的洗脫（見(jiàn)下圖），方便易行，是蛋白質(zhì)分離的常用手段之一。
八、親和色譜
所謂親和色譜就是將親和技術(shù)和色譜技術(shù)集成得到的一種高效分離手段，其原理與親和吸附基本類似，所不同的是經(jīng)過(guò)修飾的載體顆粒是填充在色譜柱中，以實(shí)現(xiàn)連續(xù)的色譜分離
載體活化、配基連接、吸附、洗脫

九、蛋白質(zhì)分離常用的色譜方法
1、免疫親和層析
屬于吸附色譜中的一種，利用抗原-抗體作用的高度專一性以及較強(qiáng)的吸附力，實(shí)現(xiàn)特殊蛋白質(zhì)的分離
免疫親和層析介質(zhì)的獲得：
（1）獲得抗體
（2）抗體連接到載體上
2、疏水層析
在載體表面連接上疏水的直鏈碳鏈或其他疏水基團(tuán)，如苯基，可以與蛋白質(zhì)的某些疏水基團(tuán)相互作用，從而實(shí)現(xiàn)多組分的分離。
3、離子交換色譜是最常用的蛋白質(zhì)分離手段
操作要點(diǎn)：
由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的pH值下，其解離程度是不同的，因此既可以采用陽(yáng)離子交換，也可以用陰離子交換，可視具體情況而定
由于蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)很多，為了避免洗脫困難，通常采用弱陽(yáng)或弱陰離子交換劑
適當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH值，使蛋白質(zhì)適當(dāng)解離，通常采用的pH值靠近其等電點(diǎn)（不是等電點(diǎn)）
緩沖溶液的離子強(qiáng)度不能過(guò)高，通常在10~20m mol
層析方案的確定，需要視試驗(yàn)情況作適當(dāng)調(diào)整
洗脫方式：pH梯度
離子強(qiáng)度梯度
思考題：
1、色譜方法共分幾類？常用的蛋白質(zhì)分離方法有哪些？并簡(jiǎn)述其原理

• 何為理論塔板高度和理論塔板數(shù)？如何計(jì)算？
• 簡(jiǎn)述高效反相液相色譜的工作原理？
• 試分析HPLC和HIC技術(shù)的異同