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實(shí)驗(yàn)原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被大鼠一氧化氮（NO）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠一氧化氮（NO）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。



樣本處理及要求

1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過一夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)��?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或?qū)��?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)��?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。


標(biāo)本處理

1. 本公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。

2. 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)標(biāo)本含量，如果標(biāo)本濃度過高，應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋，使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。標(biāo)本使用0.01mol/L的PBS稀釋(PH=7.0-7.2)。

3. 若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性，并注意留存樣本。

4. 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

5. 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間等，所以可能存在檢測(cè)不出的情況。

6. 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測(cè)抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測(cè)出。

7. 建議使用新鮮樣本，保存時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)存在蛋白降解或變性導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。



需要而未提供的試劑和器材

酶標(biāo)儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱
蒸餾水或去離子水

備注：

1. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：40、20、10、5、2.5、0 μmol/L

2. 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn)，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過zui大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。



注意事項(xiàng)

嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
不能使用過期產(chǎn)品。
如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。


試劑準(zhǔn)備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。



操作步驟

1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3. 樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。

4. 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。



實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。



試劑盒性能

1. 檢測(cè)范圍：1.25 μmol/L – 40 μmol/L。

2. 靈敏度：zui低檢測(cè)濃度小于0.1 μmol/L。

3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。



說明

1. 由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

2. zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

3. 不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，如：檢測(cè)限、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請(qǐng)依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，電子版說明書僅作參考。

4. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說明才會(huì)得到的檢測(cè)結(jié)果。