英文名稱：3D cell culture Kit

貨號：KC7186

保存條件：室溫

概述

本品為生物活性凝膠，通過模擬活體內(nèi)三維組織的微環(huán)境和形態(tài)結(jié)構(gòu)，為細胞的體外培養(yǎng)以及體內(nèi)實驗提供類似體內(nèi)細胞外基質(zhì)的三維立體微環(huán)境，支持各種細胞的三維生長。產(chǎn)品主要成分為多糖和人工多肽，不含抗原物質(zhì)和動物源性成分，無免疫原性，產(chǎn)品穩(wěn)定成分明確，
批次間差異小，實驗可重復(fù)性高，易于操作，僅需室溫操作，無需在冰上進行，本產(chǎn)品可以直接使用，無需稀釋或額外添加其他成分，僅需 2 步，孵育 5-10 min 即可形成細胞-凝膠的三維結(jié)構(gòu)，凝膠剪切力敏感，可直接進行體內(nèi)原位注射，無縫對接體內(nèi)外實驗（與細胞混合
或者不混合均可），開展動物實驗。細胞可回收培養(yǎng)，附贈溫和裂解液，裂解或降解后的成分為單糖和氨基酸，對細胞無影響。高透光性，高通透性，方便實時跟蹤觀察，可熒光觀察、顯色觀察等。

說明書

操作說明：
1 使用前，將凝膠液預(yù)熱至 37℃。
2 在離心管中將凝膠液和細胞懸液輕輕混勻，可輕柔快速斡旋 1 秒鐘，重復(fù) 1-2 次。注：凝
膠和細胞混合時，必須嚴格按照說明書，先吸取凝膠，再往凝膠中加細胞懸液，混勻，順序
不可顛倒。斡旋時間不能超過 1 秒鐘，斡旋次數(shù)不能超過 3 次，過度斡旋會破壞細胞膜并增
加凝膠中的氣泡，從而影響細胞培養(yǎng)效果。建議的最終細胞濃度為 4.2x10^5/ml-1x10^6/ml。
不同的培養(yǎng)體系請參照下表：
孔板    凝膠液體積  細胞懸液體積   培養(yǎng)基體積
96孔板  30ul/孔     30ul/孔        80ul/孔
24孔板  150ul/孔    150ul/孔       400ul/孔
12孔板  300ul/孔    300ul/孔       800ul/孔
6孔板   600ul/孔    600ul/孔       1600ul/孔
3 用 1xpbs 潤洗細胞培養(yǎng)板，然后快速貼壁加入凝膠細胞混合物，并于四周輕輕晃動，使凝
膠細胞混合物均勻鋪展。注：建議至少在凝膠形成之前 20 分鐘潤洗細胞培養(yǎng)板。
4 37℃孵育 5-30 分鐘以形成凝膠。
5 孵育完成后，沿孔壁加入培養(yǎng)液。37℃，5%CO2 條件下培養(yǎng) 24 小時。注：此期間避免晃
動培養(yǎng)板，以免破壞凝膠結(jié)構(gòu)。
6 24 h后進行半換液（用移液槍輕輕吸取上層細胞培養(yǎng)液的1/2，再添加等量的新鮮培養(yǎng)液），
此后可正常換液。注意：首次換液時一定要緊貼培養(yǎng)孔壁，小心吸取，避免吸掉剛貼附好的
細胞。
實驗中可能出現(xiàn)的問題和解決方法：運輸過程若出現(xiàn)氣泡，放置在 4 ℃冰箱，可自行消除，
如需快速消除，可微波加熱 30s。為避免使用過程中氣泡的產(chǎn)生，建議使用 1mL 無菌注射器
（去針頭使用）輕吸凝膠注入 EP 管中，也可用 PBS 潤洗的 1 mL 槍頭吸取凝膠，再將細胞懸
液加入后上下輕輕吹打即可混勻。2D 培養(yǎng)的細胞接種到凝膠中，需要 2-4 天適應(yīng)凝膠的三
維環(huán)境，期間細胞生長狀態(tài)可能會比較保守（呈圓形）。之后，細胞即正常生長，可進行后
續(xù)實驗。為避免一些類型的細胞會從凝膠中遷移到培養(yǎng)皿底部貼壁，鋪板前先將孔板包被一
層薄薄的凝膠，即可解決問題。具體方法為：將凝膠和培養(yǎng)液體積 1:1 配置，鋪在孔板底
部，待凝固之后，再鋪凝膠細胞混合液。
細胞收集與再培養(yǎng)
回收凝膠中的細胞：
棄掉培養(yǎng)液，并用裂解液沖洗，加入凝膠液 5 倍體積的裂解液，輕輕吹打數(shù)次，室溫裂解約
10 分鐘，使凝膠完全變成液體狀態(tài)，將混合液收集到離心管中，用 pbs 沖洗孔板并將收集
至上述離心管中，1500 rpm 離心，3 min，即可收集到細胞。如果細胞在凝膠內(nèi)是成團生長
的，可以在裂解時候加大裂解液體積，延長裂解時間以得到分散的單個細胞。

問題集：

1 3D細胞培養(yǎng)后如何染色？

答：3D細胞培養(yǎng)后可以直接在膠中進行染色，染色步驟同2D培養(yǎng)的細胞。不需要進行特殊處理。

2 3D細胞培養(yǎng)后怎么觀察？

答：3D細胞培養(yǎng)后可以使用Confocal或者熒光倒置顯微鏡進行觀察，光學(xué)顯微鏡也可以觀察，但是由于凝膠是立體結(jié)構(gòu)，可能光學(xué)顯微鏡觀察的效果不會太理想。

3 你們的3D細胞培養(yǎng)凝膠能進行長期培養(yǎng)嗎？

答：可以。

4 你們的3D細胞培養(yǎng)凝膠使用時需要使用配套的專用耗材或者儀器嗎？

答：不需要使用專用耗材和儀器。采用本試劑盒進行3D細胞培養(yǎng)時所用的耗材和儀器同2D培養(yǎng)。

5 你們的3D細胞培養(yǎng)凝膠試劑盒可以用于細胞共培養(yǎng)嗎？

答：可以進行細胞共培養(yǎng)。

6 你們的3D培養(yǎng)凝膠試劑盒是不是只能培養(yǎng)特定的一些細胞？

答：本試劑盒對細胞沒有選擇性，對大多數(shù)細胞都是適用的。

7 你們的3D培養(yǎng)凝膠試劑盒和Matrigel基質(zhì)膠有何不同？

答：Matrigel基質(zhì)膠主要是由層粘連蛋白,Ⅳ型膠原,巢蛋白,硫酸肝素糖蛋白等組成，是從腫瘤中提取出來的，成分復(fù)雜。本試劑盒凝膠主要是由多肽和多糖構(gòu)成，為全人工合成的，無動物源性。適用Matrigel基質(zhì)膠進行3D培養(yǎng)，其后期染色非常困難，細胞也無法回收。使用本試劑盒進行3D培養(yǎng)后的細胞可以輕松染色，并可以在保持細胞活性的情況下回收細胞。是您3D培養(yǎng)的理想選擇。

8 你們的3D培養(yǎng)凝膠和軟瓊脂一樣嗎？

答：我們的3D培養(yǎng)凝膠是人工合成的，其性能大大優(yōu)于軟瓊脂。

9.凝膠和細胞懸液混合這一步，是否有順序要求？

答：有。必須嚴格按照說明書，先吸取凝膠到容器中，再往凝膠中加入細胞懸液，混勻。順序不可顛倒。否則不利于形成穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。

10.使用中如何吸取凝膠？
答：先將槍頭尖端剪掉，用 PBS 潤洗，然后再吸取凝膠。慢慢松開移液槍的按鈕，按鈕彈回原位之后，讓槍頭在凝膠液面以下稍多停留一會兒，再提槍，轉(zhuǎn)移凝膠到其他容器中。

11.吸取凝膠與混勻凝膠過程中，產(chǎn)生的氣泡可否消除？
答：吸取與混勻凝膠過程中產(chǎn)生的氣泡不能消除，會影響后續(xù)實驗，所以，應(yīng)盡量避免氣泡產(chǎn)生。

12.怎樣達到更好的鋪板效果？
答：鋪板前，采用分區(qū)域逐滴滴加的方式，把每一滴凝膠按一定排布次序滴在孔（或皿）的不同區(qū)域，滴好之后，用槍頭在凝膠表面輕輕引流，可獲得較為均勻的鋪板結(jié)果。鋪板后將培養(yǎng)板靜置孵育 5-30min，期間不要晃動培養(yǎng)板。
13.何時首次添加培養(yǎng)液？
答：37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育 5-30 min 形成穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)后即需要添加培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液貼壁緩慢加入孔板中。
14.長期培養(yǎng)需要如何換液？
答：換液前注意先將負壓泵壓力調(diào)低。培養(yǎng) 48 小時之后再進行首次換液。換液時，棄掉2/3 左右的舊液即可，留少量舊液以避免吸走凝膠；生長快的細胞，24 h 時可以換掉一半培養(yǎng)液。首次換液時一定要緊貼培養(yǎng)孔壁，小心緩慢吸取舊液，避免吸掉剛貼附好的細胞。添加新液一定要貼壁、緩慢加入，以避免沖壞凝膠。此后可根據(jù)細胞生長速度，視培養(yǎng)液的消耗情況來換液。