國(guó)達(dá)黃曲霉毒素免疫親和柱您的食品安全專(zhuān)家

1、方法簡(jiǎn)介：

本方法是用免疫親和柱凈化，高效液相色譜熒光法檢測(cè)黃曲霉毒素 B1，B2，G1 , G2，M1和M2，此法可適用于果仁及其類(lèi)似物，干水果，谷物，調(diào)味品，茶葉，咖啡，可可，及其他食品原料和飼料。

黃曲霉毒素易溶于極性的有機(jī)試劑，因此均勻基質(zhì)中的黃曲霉利用甲醇/水通過(guò)搖晃或分散提取而得，對(duì)于高脂肪/油含量的樣品基質(zhì)需加入正己烷予以脫脂。然后過(guò)濾 PBS稀釋。但對(duì)于飼料，調(diào)味品，茶葉，咖啡，可可等不用PBS而用吐溫溶液稀釋然后經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾，然后經(jīng) HPLC柱后光化學(xué)衍生熒光檢測(cè)器檢測(cè)。

2、提取步驟：

儀器，所需試劑，溶劑

黃曲霉毒素免疫親和柱系列：免疫親和柱系列  （1ml，25支/盒；3ml，15支/盒）；

高效液相裝置：安捷倫  1200 系列 含泵，在線(xiàn)脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，熒光檢測(cè)器，柱溫箱；

光化學(xué)反應(yīng)器：Photochemical   Reactor 另帶反應(yīng)圈和 UV燈；

色譜柱：XB-C18   5µm, 250 x 4.6 mm；

預(yù)柱：C18 4 x 2 mm；均質(zhì)機(jī)；水平振蕩器；攪碎機(jī)；濾紙；漏斗；錐形瓶：100 ml；玻璃纖維過(guò)濾器；SPE轉(zhuǎn)接頭及  50ml大容量上樣器   SPE Adapter10 ml一次性注射器；

分析天平（精度 0.02 g）；1.8 mL自動(dòng)進(jìn)樣樣品瓶；移液槍?zhuān)籗PE裝置帶抽真空系統(tǒng)：SPE  Device

黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2,M1,M2混標(biāo)或需測(cè)單標(biāo)；吐溫  20；

PBS緩沖溶液：1.16 g  Na2HPO4/0.20 g  KH2PO4/ 8  g NaCl/0.2  g KCl  溶于

900ml水中，用HCL或NaOH調(diào)PH至7.4然后定容至1000ml；

磷酸氫二鈉；磷酸二氫鉀；氯化鉀；氯化鈉；去離子水；甲醇，分析純；甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；正己烷，分析純；

提取溶液：甲醇和水體積比80/20，對(duì)于泥漿樣純甲醇（分析純）作為提取溶劑單獨(dú)使用；HPLC

洗脫液A：水。

洗脫液B：甲醇/乙腈80/20 （v/v）。

吐溫溶液：100ml吐溫20溶于900ml水中

HPLC校正標(biāo)準(zhǔn)溶液：

由標(biāo)準(zhǔn)溶液配成目標(biāo)物含量為1ug/kg的校正溶液前處理步驟：

花生果仁類(lèi)似產(chǎn)品的提�。ㄩ_(kāi)心果，杏仁，杏仁殼，花生及其類(lèi)似物）：稱(chēng)取50g漿狀樣（均質(zhì)時(shí)加入100-300%水）加入5gNaCl（對(duì)于加標(biāo)樣品加入加標(biāo)溶液），加入75ml純甲醇然后均質(zhì)3分鐘或震蕩提取30分鐘。對(duì)于量少的樣品，稱(chēng)25g干燥的均勻樣，加入5g NaCl和100ml甲醇/水80/20 （v/v） 溶液，然后均質(zhì)3分鐘或震蕩30分鐘進(jìn)行提取。將提取液用濾紙過(guò)濾或離心，上清液轉(zhuǎn)移于100ml錐形瓶中。

對(duì)于特殊的花生醬或其他果仁醬，其外面有一層油脂，所以很難被提取。稱(chēng)25g樣品，加入  5g NaCl，100ml提取溶液和50ml正己烷。用均質(zhì)機(jī)提取3-5分鐘，油脂部分會(huì)溶于正己烷相，過(guò)濾收集澄清液。

谷物牛奶類(lèi)稱(chēng)取 ：

25g樣于250ml錐形瓶中，加入5g NaCl，100ml提取溶液（對(duì)于加標(biāo)樣品加入加標(biāo)溶液），然后在水平震蕩器上150 rpm震蕩30分鐘。對(duì)于奶粉樣品可稱(chēng)取2-5g加提取液溶解，如難溶解可適當(dāng)加熱，濾紙過(guò)濾，收集澄清液。

調(diào)味品，茶，咖啡，可可，飼料，醫(yī)藥品，辣椒提取物

稱(chēng)取20g干樣，50g泥漿樣，加入5g NaCl，100ml提取溶液，漿狀樣加80ml純甲醇（對(duì)于加標(biāo)樣品加入加標(biāo)溶液），然后在水平震蕩器上150rpm震蕩30分鐘。濾紙過(guò)濾，收集澄清液。取5ml濾液加入20ml吐溫溶液稀釋?zhuān)�稀釋液用玻璃纖維過(guò)濾器過(guò)濾。

空白值：

試劑空白值必須測(cè)定。

免疫親和柱（IAC）凈化

將免疫親和柱置于固相萃取裝置上，一個(gè)樣品對(duì)應(yīng)一根柱子；10ml PBS溶液活化柱子，流速保持在2–3 ml/min，確保上樣前柱子保留少量（0.5ml）的 PBS溶液，活化液不收集；

1、花生，果仁類(lèi)似物及谷物牛奶的提取液：3.1ml提取液用9.9mlPBS稀釋。用12.6ml稀釋液通過(guò)IAC，但流速不能超過(guò)5 mL/min。用約20ml去離子水淋洗柱子，其中10ml流速不得超過(guò)5 mL/min，抽真空1分鐘；

2、調(diào)味品，茶，咖啡，可可，飼料，醫(yī)藥品，辣椒提取物：9ml稀釋樣品通過(guò)免疫親和柱，流速不超過(guò) 5 mL/min。用約20ml去離子水淋洗柱子，其中10ml流速不得超過(guò)5 mL/min，抽真空1分鐘；

用1.5ml甲醇洗脫；

（將柱子接于玻璃裝置上，用0.75ml甲醇兩次將目標(biāo)物洗脫下來(lái)并收集于15ml 離心管中，起始在柱子上加壓令其大概通過(guò)4滴液滴，然后利用重力讓其自然流下，最后通入空氣令液體全部流出并收集。）

洗脫液用1.5ml水稀釋并混勻,最終體積為3ml；過(guò)濾后上機(jī)測(cè)試

注：具體免疫親和柱使用方法可參考說(shuō)明書(shū)

3. 液相色譜-熒光測(cè)定

儀器

液相色譜系統(tǒng)：

Agilent 1200二元高壓泵

Agilent 1200真空脫氣機(jī)

Agilent 1200恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器

Agilent 1200柱溫箱

光化學(xué)柱后衍生裝置

色譜柱：XB-C18    250mm x 4.6 mm 5um

預(yù)柱：C18，4 x52µmmm

流動(dòng)相：（乙腈：甲醇（50:50））：水=35:65

進(jìn)樣體積：20ul

流速：1 ml/min

柱溫：35 °C

熒光檢測(cè)器：激發(fā)：365nm；發(fā)射：450nm

激發(fā)：365nm；發(fā)射：450nm

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