一、溫度控制

對普通PCR儀來說，溫度控制指標主要是指溫度的準確性、均勻性、以及升降溫速度，對梯度PCR儀來說，除了溫度的準確性和均勻性、升降溫速度以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。

溫度的準確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性，它直接關(guān)系到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題，對于PCR反應(yīng)而言*重要的莫過于溫度控制的準確性，由于PCR是一個幾何級數(shù)擴增的過程，擴增過程中退火溫度的細微變化會被放大而直接影響結(jié)果，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度，對退火溫度而言溫控顯的尤為重要，有時1度甚至0.5度的差異也能決定實驗的成功與失敗，所謂差之毫厘，謬之千里。因而對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。

溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guān)系到在不同樣品孔進行反應(yīng)結(jié)果的一致性。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)有時用同樣的樣品，同樣的PCR反應(yīng)程序，*后的結(jié)果竟然差異非常明顯，或許就是因為不同位置的溫度不均一性所致。一些使用過早期PCR儀的腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個固定的孔，就是因為過往反復(fù)的教訓和認真的思索得出了這樣的結(jié)論，PCR儀的溫度均勻性不好，特別是*外周的樣品孔情況更差，很有可能影響實驗結(jié)果——即“位置的邊緣效應(yīng)”會影響結(jié)果的可重復(fù)性。正是這種位置效應(yīng)對定量PCR的結(jié)果的影響更為明顯，所以后來才有Roche和Cobbett的離心式定量PCR的重大創(chuàng)新。 

溫度控制除了精確度，還有一個廠家喜歡大力宣傳的指標——升降溫的速度。更快的升降溫速度，可以縮短反應(yīng)進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時間，能提高PCR反應(yīng)煌特異性。因此從本質(zhì)而言溫控方式就從以前相對穩(wěn)定耐用的機械式轉(zhuǎn)向了升降溫更快速的半導(dǎo)體。除了機械本身的原因，影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導(dǎo)熱性。例如ABI早就有升降溫速度高達5°C的黃金基座（不要誤會，是銀質(zhì)鍍金而已，要是足金在哪兒可都長久不了），*近eppendorf也推出了升降溫速度可達到6℃/秒和4.5/秒的銀質(zhì)模塊,是目前同類產(chǎn)品中升降溫速度*快的，據(jù)廠家資料，一個在其他儀器上原本需要需要40—60分鐘的PCR反應(yīng)，eppendorf Mastercycler ep（銀質(zhì)模塊）只需運行28分鐘——別小看這節(jié)約下來的幾十分鐘，一天下來就可以多運行好幾輪了。而真正常用而經(jīng)濟的材料是鋁合金。

作為用戶來說，當然更愿意選擇升降溫速度快的，這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到，而內(nèi)在的穩(wěn)定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到，儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因為樣品管與基座接觸的緊密性、導(dǎo)熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度。

現(xiàn)在的PCR儀如ABI,Eppendorf的一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式（Block-control）和反應(yīng)管溫控模式）（tube-control）。在模塊溫控模式下，機器根據(jù)探se器直接探se的溫控模塊（即承載樣品的金屬臺）的溫度進行控制，這種模式適用于長時間的靜態(tài)孵育（如連接、酶切、去磷酸化等）。反應(yīng)管溫控模式實際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式，根據(jù)探se器所探測到的溫控模塊的溫度由計算機計算出管內(nèi)/PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進行控制。一般說來，試管溫控更為準確，因為管內(nèi)樣品的溫度無法與溫控模塊同時達到預(yù)設(shè)溫度。特別是PCR反應(yīng)中的孵育過程一般都很短暫（30秒或更短），如果采用只有模塊溫控模式的話，反應(yīng)混合物孵育的時間與程序設(shè)定的時間會有相當大的差距。而反應(yīng)管控制精確的算法能自動補償時間，而且適合各種類型的反應(yīng)管，確保反應(yīng)混俁物按照程序設(shè)定的時間維持預(yù)設(shè)溫度。這里要表揚的是ABI——因為他們的宣傳資料很老實的指出，模塊升降溫速度高達3.5℃，樣品的實際平均升降溫度是1℃左右，而且ABI的PCR儀中顯示的溫度也是計算出來的樣品溫度而非溫控模塊的溫度。我們看到過有的品牌代理做的宣傳資料中故意引用ABI的“樣品實際平均升降溫速度”去和自己的模塊升溫速度比較，未免有失公允。

有的PCR儀廠家推出了另一種溫控方式；熱敏電極溫控模式。該方法將一個熱敏電極插入一個專門的測量管中（管中裝有礦物油），反應(yīng)進行時，將該測量管插入溫控模塊的樣品進行檢測。他們認為通過此途徑可以監(jiān)測反應(yīng)管內(nèi)樣品的實際溫度，但這種方法未免有些華而不實；（1）測量管中礦物油的溫度變化與實際反應(yīng)樣品的溫度變化未必一致；（2）因為測量管必須占用一個樣品孔，所以使用該溫控方式時就無法使用96孔PCR板作實驗。

原創(chuàng)作者：長沙駿逸實驗儀器有限公司