1.       細(xì)胞的沉降系數(shù)

由于分辨率取決于區(qū)帶寬度和徑向路徑的比值，沉降系數(shù)相差越大細(xì)胞區(qū)帶間距離越大，同一細(xì)胞株沉降系數(shù)分布越小細(xì)胞區(qū)帶越窄，分辨越高，越容易分離，在分離沉降系數(shù)相差很小的細(xì)胞時(shí)，應(yīng)盡可能保持起始細(xì)胞懸浮液區(qū)帶寬度窄小，加樣量少，梯度柱要長(zhǎng)，即用長(zhǎng)離心管進(jìn)行分離，以彌補(bǔ)沉降系數(shù)對(duì)分辨率的不利影響。

2.       梯度的密度范圍

細(xì)胞密度必須大于梯度介質(zhì)的密度，盡可能使用*小密度和黏度的梯度進(jìn)行，以便在*短的時(shí)間內(nèi)完成分離。

3.       梯度體積

分離細(xì)胞的數(shù)量和分離裝置不同，梯度的體積變化范圍很大，即梯度體積受所使用轉(zhuǎn)子和回收方法所制約，一般從5ml和1600ml不等。不像等密度離心，在很少的梯度介質(zhì)里進(jìn)行速度分離很難成功。

4.       細(xì)胞裝樣量

由于細(xì)胞相互作用或細(xì)胞與細(xì)胞間的締合是細(xì)胞濃度的函數(shù)。有兩個(gè)問(wèn)題，一是給梯度上加多少細(xì)胞能夠獲得所需的分辨率；二是細(xì)胞懸浮液的濃度多大才不至于引起細(xì)胞聚集并且能回收到適合研究用的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞純度。由于各種組織來(lái)源的細(xì)胞差異很大，受污染細(xì)胞的數(shù)量和梯度介質(zhì)分辨本領(lǐng)所限，很難制定一種普遍適用的方法，一般根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定或根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行，前面討論的理論方法在實(shí)際應(yīng)用中有一定局限性。

5.       離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間

*佳分離離心轉(zhuǎn)速的選擇受若干因素所影響，包括細(xì)胞大小和密度、介質(zhì)的黏度和密度范圍。不管怎樣，所施加的離心力要足以使細(xì)胞在介質(zhì)中能夠移動(dòng)，并且在適當(dāng)時(shí)間內(nèi)遷移到一定的距離范圍。若離心轉(zhuǎn)速太低，需要離心時(shí)間太長(zhǎng)，如在高黏度介質(zhì)中分離心肌細(xì)胞時(shí)，離心時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧而死亡。若離心轉(zhuǎn)速太高，小細(xì)胞也快速通過(guò)梯度，甚至在較短時(shí)間內(nèi)到達(dá)管底，重新與大細(xì)胞混雜在一起。因此，在速度離心中，離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間是至關(guān)重要的，為了減少不穩(wěn)定細(xì)胞受損或某些因子活性喪失，采用較高的轉(zhuǎn)速盡快完成分離。若較大的細(xì)胞沉降速度太長(zhǎng)，可使用高粘性梯度介質(zhì)，使其自愛(ài)梯度中以合適的速度沉降。

6.       穩(wěn)定

分離細(xì)胞多在室溫（20~25℃）下進(jìn)行，少數(shù)情況下在4℃下進(jìn)行。