材料、設(shè)備及試劑
　　 一、 材料
　　 λDNA: 購(gòu)買(mǎi)或自行提取純化; 重組pBS質(zhì)料或pUC19質(zhì)粒; EcoRI酶及其酶切緩沖液: 購(gòu)買(mǎi)成品; HindⅢ酶及其酶切緩沖液: 購(gòu)買(mǎi)成品;瓊脂糖(Agarose): 進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。
　　 二、 設(shè)備
　　 水平式電泳裝置,電泳儀,臺(tái)式高速離心機(jī), 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機(jī)及其附件。
　　 三、 試劑
　　 1、 5×TBE電泳緩沖液：配方見(jiàn)章。
　　 2、 6×電泳載樣緩沖液：0.25％ 溴粉藍(lán)，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
　　 3、 溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于 室溫即可。
第三節(jié) 操作步驟
　　 一、 DNA酶切反應(yīng)
　　 1、 將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(0.5ml)編號(hào),用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機(jī)甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵,要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開(kāi)冰箱的時(shí)間，以免活性降低。
　　 2、 混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37℃水浴保溫2-3小時(shí),使酶切反應(yīng)完全。
　　 3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?
　　 二、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備
　　 采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來(lái)作為電泳時(shí)的分子量標(biāo)準(zhǔn)。λDNA為長(zhǎng)度約50kb的雙鏈DNA分子,其商品溶液濃度為0.5mg/ml,酶解反應(yīng)操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個(gè)片段,長(zhǎng)度分別為23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6個(gè)片段,長(zhǎng)度 分別為21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。
　　 三、 瓊脂糖凝膠的制備
　　 1、 取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。
　　 2、 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。
　　 3、 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。
　　 4、 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過(guò)樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。
　　 5、 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源�？刂齐妷罕３衷�60-80V,電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí),停止電泳。
　　 6、 染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。
　　 7、 觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。 經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時(shí)間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。
　　 8、 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點(diǎn),用卡尺測(cè)量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),以遷移距離為橫坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 9、 DNA酶切片段大小的測(cè)定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據(jù)此數(shù)值,在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對(duì)數(shù)值,進(jìn)一步計(jì)算出各片段的分子量大小(若用單對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它預(yù)計(jì)的遷移距離。
　　 10、 DNA酶切片段排列順序的確定：根據(jù)單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結(jié)果,對(duì)照DNA酶切片段大小的數(shù)據(jù)進(jìn)行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點(diǎn)的相對(duì)位置。以環(huán)狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內(nèi)切酶圖譜。
　　 [注意] 1.酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。
　　 2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在*適反應(yīng)條件下，1小時(shí)完全降解1mg lDNA的酶量為一個(gè)單位，但是許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不象lDNA那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過(guò)量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。
　　 3、市場(chǎng)銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見(jiàn)，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。
　　 4、 觀察DNA離不開(kāi)紫外透射儀,可是紫外光對(duì)DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時(shí),應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈(300-360nm）,以減少紫外光切割DNA。
　　 5、 EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門(mén)處理后才能清洗或丟棄。
　　 6、 當(dāng)EB太多,膠染色過(guò)深,DNA帶看不清時(shí),可將膠放入蒸餾水沖泡,30分鐘后再觀察。

 

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