細(xì)胞離心技術(shù)

　　離心是研究如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體，以及各種大分子基本手段。一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機稱為高速離心機；轉(zhuǎn)速超過25Kr/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機。目前超速離心機的轉(zhuǎn)速可達(dá)100Kr/min，離心力超過500Kg。

    （一）、差速離心（differential centrifugation）

    在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。

    在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、*后為核蛋白體。

    由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會好一些。

    差速離心只用于分離大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。通過差速離心可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。

速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

    （二）、密度梯度離心（density gradient centrifugation）

    用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對細(xì)胞無毒。

A等速度沉降，B等密度沉降

    1、速度沉降

    速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的*小密度。

    生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。

    2、等密度沉降 

    等密度沉降（isopycnic sedimentation）適用于分離密度不等的顆粒。

    細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。

    等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進(jìn)行。介質(zhì)的密度應(yīng)大于被分離組分的密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。再者，這種方法所需要的力場通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速離心，離心時間也較長。大的離心力、長的離心時間都對細(xì)胞不利。大細(xì)胞比小細(xì)胞更易受高離心力的損傷，而且停留在等密度介質(zhì)中的細(xì)胞比處在移動中的細(xì)胞受到更大的損傷。因此，這種方法適于分離細(xì)胞器，而不太適于分離和純化細(xì)胞

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