離心分離方法

（一）差速離心法

　　它利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。

　　差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。

　　（二）速率區(qū)帶離心法

　　速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處（X₁）的介質(zhì)密度*小，離旋轉(zhuǎn)軸*遠(yuǎn)處（X₂）介質(zhì)的密度，但介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的*小密度，即ρ_P＞ρ_m。這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時(shí)起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機(jī)械振動(dòng)而引起已分層的粒子再混合。

　　由于ρ_P＞ρ_m可知S＞0，因此該離心法的離心時(shí)間要嚴(yán)格控制，既有足夠的時(shí)間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達(dá)到沉淀前。如果離心時(shí)間過長(zhǎng)，所有的樣品可全部到達(dá)離心管底部；離心時(shí)間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。

　�。ㄈ┑让芏入x心法

　　等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當(dāng)梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，即ρ_m＞ρ_P時(shí)粒子上浮；在彎頂處ρ_P＞ρ_m時(shí)，則粒子沉降，*后粒子進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置即ρ_P＝ρ_m，此時(shí)dx/dt為零粒子不再移動(dòng)，粒子形成純組份的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長(zhǎng)離心時(shí)間也不能改變這些粒子的成帶位置。

　　此法一般應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時(shí)。常用的梯度液是CsCl。

　�。ㄋ模┨荻热芤旱闹苽�

　�、碧荻炔牧系倪x擇原則作為一種理想的梯度材料應(yīng)具備以下幾點(diǎn)：①與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開。②可達(dá)到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強(qiáng)度和pH變化較小。③不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。④容易純化，價(jià)格便宜或容易回收。⑤濃度便于測(cè)定，如具有折光率。⑥對(duì)于超速離心分析工作來說，它的物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料：①糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。②無機(jī)鹽類：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。③有機(jī)碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。④硅溶膠：如Percoll。⑤蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機(jī)物：如氟代碳等。

　�、蔡荻炔牧系膽�(yīng)用范圍

　　⑴蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其密度可達(dá)1.33g/ml，且由于價(jià)格低容易制備，是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細(xì)胞的分離。

　�、凭壅崽牵荷唐访鸉icoll，常采用Ficoll-400也就是相對(duì)分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。

　�、锹然C：是一種離子性介質(zhì)、水溶性大，密度可達(dá)1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時(shí)形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價(jià)格較貴。

　�、塞u化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。

　�、蒔ercoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（PVP），滲透壓低，它對(duì)生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強(qiáng)度下不穩(wěn)定。它可用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離。

原創(chuàng)作者：長(zhǎng)沙駿逸實(shí)驗(yàn)儀器有限公司