PCR的優(yōu)化

   在PCR的優(yōu)化開始階段，應(yīng)用新的DNA模板，引物或熱穩(wěn)定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其擴增效果一般總不是*佳的。這種PCR反應(yīng)通常要求盡量抑制非特異性擴增和（或）增加目的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)率。表1列舉了一些通常遇到的問題和對PCR反應(yīng)進行優(yōu)化的一些推薦方法。
表1 PCR擴增的疑難解析
問題 解釋 補救措施
目的產(chǎn)物條帶在兩種陽性對照管與試驗管內(nèi)部呈現(xiàn)明顯的非常模糊的帶型。目的產(chǎn)物條帶有時呈不清晰的成片條帶，條帶在凝膠中擴散到較期望分子量更小的DNA分子量的區(qū)域內(nèi)。 無效引導(dǎo)或無效延伸 通過建立兩個引物不同濃度的PCR系列試驗，從中發(fā)現(xiàn)兩個引物的*適濃度；通過建立降落PCR系列試驗，摸索*佳鎂離子濃度的水平。
應(yīng)用GC-Melt（Clonte-CH）PCR反應(yīng)混合液。
應(yīng)用盡可能低的復(fù)性溫度（即退火溫度）考慮添加佐劑，如在反應(yīng)體系中加牛白蛋白（0.2~0.6mg/ml），二甲基亞砜（5%）或甘油（5%）
目的產(chǎn)物條帶在陽性對照管2與試驗管內(nèi)呈現(xiàn)非常模糊的帶型，而在陽性對照管1內(nèi)卻又很強的條帶。 模板DNA不純。 重新純化模板DNA，用酚：氯仿抽提兩次，乙醇沉淀回收。純化后的DNA樣品溶解于水中（不含EDTA）。
在陰性對照管擴增出目的條帶。 盛模板DNA的塑料器具溶解模板DNA的溶液污染所致。 重新配置新的試劑。
擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的分子質(zhì)量錯誤的條帶。 根據(jù)一條或兩條引物的非特異性引導(dǎo)。 縮短復(fù)性時間或增加復(fù)性溫度。
擴增目的產(chǎn)物DNA呈現(xiàn)模糊的廣泛的成片條帶。 要么為引物二聚體所致的擴增；要么為模板DNA過量。 檢查引物是否均一及模板DNA序列內(nèi)是否具有高度重復(fù)序列存在。優(yōu)化每條獨立引物的濃度。
應(yīng)用降落PCR和（或）熱啟動PCR。降低模板DNA的量。

對可能發(fā)生在PCR過程中的主要問題的解析
表2描寫在PCR擴增反應(yīng)中可能遇到的一些問題以及提供怎樣解決這些問題的一些方法。
表2 多種PCR擴增過程的一些疑難問題的診斷與解決方法
癥狀 可能原因 補救措施
擴增的目的產(chǎn)物條帶較弱或不能檢測到相應(yīng)的條帶。 試劑不合格；PCR儀有故障；擴增程序設(shè)置錯誤。 在兩臺不同的PCR儀上用新鮮購買的試劑與老的試劑分別進行PCR，比較其擴增產(chǎn)物結(jié)果。
復(fù)性條件不是*合適的。 重新計算引物Tm；應(yīng)用降落PCR，再結(jié)合熱啟動PCR。
驗證引物濃度，如果必要可優(yōu)化引物的濃度；若引物顯然是問題的癥結(jié)所在，重新設(shè)計合成新的引物。
被復(fù)性結(jié)合到模板上的引物不適合延伸。 優(yōu)化MgCl2、模板DNA和dNTP的濃度；試驗此PCR的pH值的范圍；考慮用N-三甲基甘氨酸、N,N-二羥乙基甘氨酸或EPP等具有更低溫度變異系數(shù)的化學(xué)物質(zhì)替代Tris（Cheng et al. 1994）。
應(yīng)用新鮮制備的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
重新純化模板DNA以去除抑制物。
在恒定復(fù)性溫度（55℃）條件下增加PCR循環(huán)數(shù)。
如果問題依然存在，添加增強劑（如10%二甲基亞砜，5% PEG6000或10%甘油）。
如果問題依然存在，用首次擴增的PCR產(chǎn)物進行1：100稀釋后作為模板，再加入新的PCR緩沖液與引物在恒定復(fù)性溫度條件下進行30個循環(huán)的第二次PCR擴增；或者進行嵌套式PCR擴增。
應(yīng)用GC-Melt（CLONTECH）PCR反應(yīng)混合液。
變性不完全。 增加變性的時間或者設(shè)置更高的變性溫度。
兩個引物之間的距離太大。 應(yīng)用那些能夠擴增大DNA片段的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
多種擴增產(chǎn)物條帶 應(yīng)用降落PCR，再結(jié)合熱啟動PCR或加強PCR（booster PCR）。
優(yōu)化MgCl2、模板DNA、熱穩(wěn)定DNA聚合酶及dNTP的濃度。
用首次擴增的PCR產(chǎn)物進行1：100稀釋后作為模板，再加入新的PCR緩沖液與引物在恒定復(fù)性溫度條件下進行30個循環(huán)的第二次PCR擴增；或者進行嵌套式PCR擴增；或者從凝膠上切割目的條帶作模板重新進行PCR擴增。
確證引物的濃度，如果必要，可優(yōu)化引物的濃度；若問題仍然存在，重新設(shè)計合成引物。
引物二聚體過量 應(yīng)用降落PCR，再結(jié)合熱啟動或加強PCR（booster PCR）；若問題仍然存在，重新設(shè)計合成引物，要特別注意引物3’末端的序列。

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