操作步驟
　　 一、 細(xì)菌的培養(yǎng)和收集
　　 將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基（含50μg/ml Amp）中, 37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)。用無(wú)菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基（含50μg/ml Amp）中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。
　　 二、 質(zhì)粒DNA少量快速提取
　　 質(zhì)粒DNA小量提取法對(duì)于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。這些方法共同特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，能同時(shí)處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
　　 （一）、煮沸法
　　 1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ離心30秒。
　　 2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。
　　 3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。
　　 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml）, 渦旋振蕩3秒鐘。
　　 5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
　　 6、用微量離心機(jī)4℃下12000g離心10分鐘。
　　 7、用無(wú)菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。
　　 8、取20ml進(jìn)行電泳檢查。
　　 [注意] 1. 對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。
　　 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時(shí),細(xì)菌裂解效果反而不好。有時(shí)不同溶菌酶也能溶菌。
　　 3. 提取的質(zhì)粒DNA中會(huì)含有RNA,但RNA并不干擾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應(yīng)等。
　　 （二）、 堿法
　　 1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。
　　 2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。
　　 3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中（需劇烈振蕩）,室溫下放置5-10分鐘。
　　 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物（千萬(wàn)不要振蕩）,冰浴5分鐘。
　　 5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。
　　 6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿（1:1）,振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。
　　 7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無(wú)水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。
　　 8、棄上清,將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。
　　 9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。
　　 10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液（pH8.0，含20μg /ml RNaseA）中，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。
　　 [注意] 1. 提取過(guò)程應(yīng)盡量保持低溫。
　　 2. 提取質(zhì)粒DNA過(guò)程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨(dú)用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。
　　 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時(shí)間稍長(zhǎng)可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇（一般使用等體積）,且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來(lái),所以多數(shù)還是用乙醇。
　　 （三）、Wizard少量 DNA 純化系統(tǒng)
　　 Promega公司的Wizard少量DNA純化系統(tǒng)可快速有效的抽提質(zhì)粒DNA,整個(gè)過(guò)程只需15分鐘。提取的質(zhì)�？芍苯佑糜贒NA測(cè)序、酶切分析和體外轉(zhuǎn)錄等。
　　 該系統(tǒng)中所含試劑和柱子可以用于50次1-3ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化，試劑包括10ml細(xì)胞懸浮液，10ml細(xì)胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA純化樹(shù)脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml ）和50支Wizard微型柱。
　　 1、 1-3ml過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞液4℃下 12000g離心1-2分鐘。
　　 2、去除上清液，菌體細(xì)胞懸浮于200μl 細(xì)胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。
　　 3、 加200μl 細(xì)胞裂解液, 顛倒離心管數(shù)次,直到溶液變清亮。
　　 4、加200μl 中和液,顛倒離心管數(shù)次。
　　 5、4℃下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。
　　 6、加1ml Wizard少量 DNA 純化樹(shù)脂,顛倒離心管數(shù)次以充分混勻。
　　 7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進(jìn)入微型柱。
　　 8、將注射器與微型柱分開(kāi),取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml柱洗液,并用注塞輕推，使柱洗液進(jìn)入微型柱。
　　 9、取出微型柱置于eppendorf管中,離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。
　　 10、將微型柱放在一個(gè)新eppendorf管中，加50μl TE（或水）于微型柱中，靜止1分鐘后，4℃下12000g離心20秒。
　　 11、丟棄微型柱，將eppendorf管中的質(zhì)粒DNA貯于4℃或-20℃冰箱。
　　 [注意] 樹(shù)脂使用前應(yīng)充分混勻,如有結(jié)晶,可將樹(shù)脂用25-37℃水浴處理10分鐘。
　　 三、質(zhì)粒DNA的大量提取和純化
　　 在制作酶譜、測(cè)定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進(jìn)一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
　　 （一）、堿法
　　 1、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的含pBS質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液250ml，4℃下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。
　　 2、將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中（此步可省略）。
　　 3、同步驟1方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。
　　 4、將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細(xì)胞。
　　 5、加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴10分鐘。
　　 6、加9ml用冰預(yù)冷的溶液III, 搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。
　　 7、4℃下5000g離心15分鐘。
　　 8、取上清液,加入50ml RNA酶A（10mg/ml）, 37℃水浴20分鐘。
　　 9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。
　　 10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。
　　 11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG（分子量6000）, 冰上放置60分鐘。
　　 12、4℃下12000g離心15分鐘, 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。
　　 13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。
　　 [注意] 1. 提取過(guò)程中應(yīng)盡量保持低溫。
　　 2. 加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。
　　 3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時(shí)應(yīng)先對(duì)該酶液進(jìn)行熱處理（80℃ 1小時(shí)）,使DNA酶失活。
　　 （二）、Wazard大量DNA純化系統(tǒng)
　　 堿法大量提取DNA往往需要很長(zhǎng)的時(shí)間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統(tǒng)既簡(jiǎn)單又快速,只需要離心和真空抽干,這個(gè)系統(tǒng)可以從500ml培養(yǎng)液中在3小時(shí)以內(nèi)獲得1mg以上的高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA（200-20000bp）。該系統(tǒng)不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA溶于水或TE緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反應(yīng)，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等。
該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可以用于10次100-500ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化,試劑包括: 150ml 細(xì)胞懸浮液，150ml 細(xì)胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA純化樹(shù)脂，125ml Wizard柱子洗脫溶液和10支 Wizard帶有存儲(chǔ)離心管的柱子。
　　 1、100-500ml細(xì)胞培養(yǎng)液置離心管中, 22-25℃下5000g離心10分鐘, 所得細(xì)胞沉淀充分懸浮于細(xì)胞懸浮液中。
　　 2、 加15ml細(xì)胞裂解溶液并輕輕混合,可以反復(fù)倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細(xì)胞裂解完全時(shí),溶液會(huì)變清,這一步需要20分鐘。
　　 3、 加15ml中和溶液,立即反復(fù)倒置離心管數(shù)次，并使之混勻。
　　 4、 14000g,22-25℃離心15分鐘。
　　 5、 小心地將上清液吸出并移至一個(gè)新離心管中。
　　 6、 加0.5倍體積的異丙醇,混合均勻, 14000g 22-25℃下離心15分鐘。
　　 7、 棄上清,懸浮DNA沉淀于2ml TE緩沖液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。
　　 8、 加10ml Wizard大量DNA純化樹(shù)脂溶液, 并渦旋混合。
　　 9、每一個(gè)樣品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的頭插在真空器上（Promega產(chǎn)品,與此配套）。
　　 10、將樹(shù)脂/DNA混合液轉(zhuǎn)入柱子中,真空抽取樹(shù)脂/DNA混合液。
　　 11、將樹(shù)脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脫溶液至離心管中, 對(duì)管底部的樹(shù)脂/DNA進(jìn)行洗脫（柱子一邊旋轉(zhuǎn)一邊加入洗脫液），并加入柱子中。
　　 12、真空抽干所加入的洗脫。
　　 13、 再加12ml柱子洗脫液進(jìn)柱子并抽干。
　　 14、 加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹(shù)脂, 柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm（1300g）離心5分鐘。
　　 15、 取出柱子，真空抽干5分鐘,再將柱子放入系統(tǒng)中所提供的離心管中，2500rpm（1300g）離心5分鐘。
　　 16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃預(yù)熱過(guò)的滅菌重蒸水或TE,1分鐘后2500rpm（1300g）離心柱子/離心管5分鐘。
　　 17、 取出柱子,離心管中溶液即為提取的質(zhì)粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子，儲(chǔ)存在4℃或-20℃?zhèn)溆谩?
　　 [注意] 1. 在使用之前,系統(tǒng)所提供的柱子洗脫液按1:1加入125ml 95％乙醇。
　　 2. 純化樹(shù)脂必須混勻后再用.
　　 （三）、Sephrose 2B柱純化質(zhì)粒DNA
　　 堿法提取的質(zhì)粒DNA即使用RNA酶處理,仍會(huì)含有少量RNA。當(dāng)有些試驗(yàn)需無(wú)RNA污染的DNA制品時(shí),則需進(jìn)行進(jìn)一步純化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B進(jìn)行純化,該方法具有快速,條件溫和,重復(fù)性好,載體物質(zhì)可以再利用等優(yōu)點(diǎn),因而已廣泛用于質(zhì)粒DNA純化。
　　 1、將Sepharose 2B經(jīng)含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。
　　 2、將至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase 2B柱上。
　　 3、待DNA溶液完全進(jìn)入柱內(nèi)后立即在柱的上部連接含有0.1% SDS的TE（pH8.0）貯液瓶。
　　 4、以1ml流出液為1份進(jìn)行收集。
　　 5、對(duì)每一管測(cè)定其OD260值,以確定哪些管中含有質(zhì)粒DNA。通常質(zhì)粒DNA在柱上流出的個(gè)峰中。
　　 6、合并所有含質(zhì)粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿（1:1）抽提,4℃下12000g離心2分鐘,將上層水相轉(zhuǎn)入新管。
　　 7、加入2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇，-20℃下沉淀10分鐘,然后4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。
　　 8、沉淀加70%乙醇洗滌,4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。
　　 9、 沉淀真空抽干,重新溶于TE或無(wú)菌水中。
　　 [注意] 在裝柱過(guò)程中,要防止柱床中出現(xiàn)斷裂或氣泡現(xiàn)象,要使界面保持平整。對(duì)新裝成的柱,應(yīng)用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱內(nèi)的凝膠均勻。

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