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定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題(二)
點(diǎn)擊次數(shù)：1288 發(fā)布時(shí)間：2008/9/16 20:45:01
8. 什么是背景校正？多長(zhǎng)時(shí)間執(zhí)行一次背景校正？
背景校正程序測(cè)量定量PCR儀所使用的反應(yīng)管和水的空白熒光強(qiáng)度。在運(yùn)行校正程序期間，定量PCR儀在10分鐘內(nèi)連續(xù)讀取背景校正板的熒光強(qiáng)度，信號(hào)收集的溫度為60 °C。隨后，SDS軟件計(jì)算所收集到的熒光強(qiáng)度的平均值，提取結(jié)果并保存到校正文件中。軟件在今后的分析中將自動(dòng)調(diào)用此校正文件，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中扣除背景信號(hào)。
因?yàn)楸尘盁晒獾男盘?hào)強(qiáng)度隨著許多外界因素（比如外來(lái)的污染、反應(yīng)板/反應(yīng)管的生產(chǎn)廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進(jìn)行背景校正，一般每三個(gè)月到半年校正一次。
9. 什么是純熒光校正？多長(zhǎng)時(shí)間校正一次？
純熒光校正是測(cè)定各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的波長(zhǎng)和信號(hào)強(qiáng)度，通俗地說(shuō)是讓儀器“認(rèn)識(shí)”各種熒光染料。軟件收集并儲(chǔ)存各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信息。以后每次定量實(shí)驗(yàn)運(yùn)行過(guò)程中，SDS軟件收集樣品的原始光譜信號(hào)，并將此原始光譜與純熒光文件中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，精確扣除不同染料的信號(hào)重疊部分，從而確定樣品中的熒光染料種類和信號(hào)強(qiáng)度。
推薦每隔半年進(jìn)行一次純熒光校正。在運(yùn)行光譜校正之前，請(qǐng)行背景校正和ROI校正。
10.96孔板怎樣封膜？
當(dāng)使用96孔板做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，推薦使用光學(xué)膜代替蓋子來(lái)密封反應(yīng)孔。正確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然后橫向，*后沿著板的邊緣按壓使之密封。具體手法見(jiàn)下面圖示：
11.使用單管或8連管做實(shí)驗(yàn)時(shí)，在樣品加熱塊上應(yīng)該怎樣安排放置？
使用單管或8連管做實(shí)驗(yàn)，并且樣本數(shù)量不多的時(shí)候，建議在樣品加熱塊(TRAY)上對(duì)稱地安放樣品，是縱向放置，并且優(yōu)先放在第6列或第7列，然后逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來(lái)的時(shí)候不至于發(fā)生傾斜，各個(gè)反應(yīng)管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的數(shù)據(jù)精密性。
12.絕對(duì)定量與相對(duì)定量有什么區(qū)別？
絕對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說(shuō)的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總�(gè)樣本中的拷貝數(shù)。舉例來(lái)說(shuō)，如果研究項(xiàng)目中包括處理過(guò)的和未經(jīng)處理的對(duì)照樣本，通�？梢詫⑽唇�(jīng)處理的樣本指定為基準(zhǔn)，規(guī)定其目的基因濃度為100%，將經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果除以對(duì)照樣品的定量結(jié)果，就可以計(jì)算各個(gè)處理樣本的基因含量相對(duì)于未處理樣品的百分比。
絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為簡(jiǎn)便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個(gè)已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。
CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對(duì)數(shù)成反比的數(shù)學(xué)關(guān)系，來(lái)計(jì)算不同樣本之間的相對(duì)百分比，其計(jì)算公式是
絕對(duì)定量的數(shù)據(jù)易于理解，但是絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的制備和測(cè)定其DNA含量比較困難。有許多商業(yè)性的標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒供選購(gòu)，可以解決這種困難。相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品容易在實(shí)驗(yàn)室里自己制備，但是數(shù)據(jù)處理比較麻煩，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的解釋有一定難度。
13.定量PCR基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？
總的來(lái)說(shuō)，有三個(gè)層次的校正是必須要做的。
首先，參比信號(hào)校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由于反應(yīng)總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號(hào)波動(dòng)都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映PCR進(jìn)程。ROX校正能夠極大地改進(jìn)定量的精確度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。
其次，內(nèi)對(duì)照校正。實(shí)驗(yàn)中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來(lái)自不同數(shù)目的細(xì)胞，所以將實(shí)驗(yàn)結(jié)果校正到每個(gè)細(xì)胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同時(shí)定量一個(gè)內(nèi)對(duì)照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S。內(nèi)對(duì)照校正使不同樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以相互比較。
第三，計(jì)算相對(duì)于基準(zhǔn)樣品(Calibrator)的相對(duì)基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時(shí)和6小時(shí)的、正常和患病的之間的基因表達(dá)的差別，則需要計(jì)算處理/未處理、6小時(shí)/0小時(shí)、患病/正常。
14.標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對(duì)定量的數(shù)據(jù)應(yīng)該怎么處理？
假設(shè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時(shí)IL-2基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用的內(nèi)對(duì)照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測(cè)定結(jié)果都是總RNA的pg數(shù)，數(shù)據(jù)的處理方法見(jiàn)下表：
15.什么是CT值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？
CT值與起始DNA濃度的對(duì)數(shù)成反比：
如果(1)不同管之間的PCR反應(yīng)效率相同；(2)這些PCR的反應(yīng)效率接近100%，可以從上面的公式推出相對(duì)含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT
假設(shè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時(shí)IL-2基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用內(nèi)對(duì)照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測(cè)定結(jié)果都是CT值，而沒(méi)有通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總RNA的pg數(shù)。數(shù)據(jù)的處理方法見(jiàn)下表：
16.每個(gè)反應(yīng)管中可以加入多少種探針？
每個(gè)反應(yīng)管中可以加入的探針數(shù)目，取決于儀器、軟件、試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等幾個(gè)方面。
首先是儀器的硬件構(gòu)成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下，全波長(zhǎng)檢測(cè)的定量PCR儀如激光管-CCD類型對(duì)于探針的數(shù)量實(shí)際上是沒(méi)有限制的。如果信號(hào)的采集要通過(guò)濾色片，那么探針的數(shù)量取決于濾色片的數(shù)目，增加探針需要增加或改變?yōu)V色片。改動(dòng)儀器的結(jié)構(gòu)通常很困難。以AB公司的儀器為例，7900和7700是激光-全波長(zhǎng)檢測(cè)的，7000、7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。
其次是化學(xué)上的可能性。不同的熒光基團(tuán)要組合到一起，在同一反應(yīng)管內(nèi)使用，必須其激發(fā)波長(zhǎng)既相對(duì)靠近又不能靠得太近，既保證信號(hào)激發(fā)的效率又保證信號(hào)不重疊干擾，能夠區(qū)分清楚�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的熒光基團(tuán)種類有限，滿足這樣條件的分子組合更少。目前的*佳組合只能達(dá)到每組4到5種熒光的水平。
第三是實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和選用的探針類型。定量PCR實(shí)驗(yàn)必須使用ROX校正熒光，占去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(tuán)(TAMRA)也要占用一種熒光，對(duì)于4色檢測(cè)的儀器來(lái)說(shuō)，只剩下2種熒光可以標(biāo)記探針，對(duì)于5色檢測(cè)的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針，由于它的淬滅基團(tuán)是不發(fā)熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標(biāo)記探針。如果實(shí)驗(yàn)要求不高，不做ROX校正（AB公司不推薦這樣做），還可以再多一種熒光用于標(biāo)記探針。
第四是研究應(yīng)用本身的要求。如果研究SNP和基因突變，因?yàn)榻^大多數(shù)人類基因是2態(tài)的，只存在兩種等位基因，2條探針已經(jīng)足夠。如果研究基因表達(dá)，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個(gè)內(nèi)對(duì)照，3色也就足夠了。
*后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高數(shù)據(jù)精確度，二是節(jié)省反應(yīng)成本。同時(shí)測(cè)定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5種探針，就要同時(shí)加入8-10條引物。在引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要考慮到盡量減少這些引物之間的競(jìng)爭(zhēng)和抑制等多種干擾，平衡各對(duì)引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的，但是要花費(fèi)大量時(shí)間、人力和物力來(lái)篩選*佳引物組合、優(yōu)化反應(yīng)條件。如果實(shí)驗(yàn)規(guī)模不大，在總體上可能反而不合算。
在實(shí)際應(yīng)用中，不是單純追求加入的探針越多越好，而是追求總體效益的*優(yōu)化。比較切合實(shí)際的是2到3重反應(yīng)，引物和探針的設(shè)計(jì)不太困難，反應(yīng)條件的優(yōu)化也不太麻煩，同時(shí)降低了成本。
17.等位基因鑒定實(shí)驗(yàn)（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不進(jìn)行ROX熒光校正？
不，等位基因鑒定實(shí)驗(yàn)也要進(jìn)行ROX熒光歸一，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密可靠。
由于試劑加樣操作的誤差、離心管熱量傳遞的誤差、離心管蓋透光性能的誤差等偶然因素是不可避免的，必然導(dǎo)致熒光激發(fā)效率的差異，因此儀器收集到的原始信號(hào)必須進(jìn)行歸一化校正，相互之間才可以比較并保證重現(xiàn)性。
這種校正是通過(guò)在反應(yīng)緩沖液中添加ROX校正熒光來(lái)實(shí)現(xiàn)的。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號(hào)的高低變化只與上述物理方面變化的總體效應(yīng)有關(guān)。將報(bào)告熒光的信號(hào)除以ROX熒光的信號(hào)，就能夠消除所有這些物理因素所引起的數(shù)據(jù)波動(dòng)。
18.內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法哪種數(shù)據(jù)更精密？
是同樣可靠的。內(nèi)標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的反應(yīng)條件*接近一致，缺點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針相互之間會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制，導(dǎo)致它們的PCR效率有差異。外標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針之間沒(méi)有發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制的機(jī)會(huì)，但是不同管之間的反應(yīng)條件差異比同管的要大，也會(huì)導(dǎo)致它們的PCR效率有差異。兩相比較，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的數(shù)據(jù)精確度是一樣的。
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