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抗血清的制備中離心機的應用
點擊次數：1049 發(fā)布時間：2008/9/10 22:57:42
(一)實驗目的
(1)了解抗血清制備的基本原理。
(2)掌握抗血清制備的操作步驟及方法。
(二)實驗原理
用具有抗原性的物質注入健康動物機體后，將引起免疫應答，并會形成漿細胞，分泌抗體。抗體主要存在于血清中，經一定次數注射，使血清中的抗體組達到要求濃度，然后采集動物血液，再從血液中分離出血清，從而獲得抗血清。為了獲得特異性強，效價高的抗血清，除了抗原的因素外，還需注意動物品系的選擇、抗原注射的濃度、劑量、次數、間隔時間及注射途徑等。對于免疫原性較弱的可溶性抗原(如蛋白質類抗原)要加入佐劑，以增強免疫性。本次實驗是用顆粒性抗原(蘇云金芽胞桿菌鞭毛及菌體抗原)制備相應的抗血清，這類抗原的免疫原性較強，不需加入佐劑也能獲得特異性強、效價高的抗血清。
（三）實驗器材
(1)活材料：
1)蘇云金芽胞桿菌醋螟亞種(Bacillus thuringiensis subsp.galleria血清型H5ab)、加拿大變種(Bacillus thuringiensis var.canadensis 血清型H5ac)、庫斯塔克亞種(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki血清型H3abc)未知血清型的蘇云金芽胞桿菌。
2)動物 家免(大耳白，2—3kg),健康雄性或未孕雌免。
(2)培養(yǎng)基：供試培養(yǎng)基的配方如表1所示。
表1 三種培養(yǎng)基配方
| 培養(yǎng)基 | 培養(yǎng)基配方 | ||||
| 牛肉膏/% | 蛋白胨/% | 氯化鈉/% | 瓊脂/% | pH值 | |
| 軟瓊脂培養(yǎng)基 | 1.0 | 1.0 | 0.2 | 0.5 | 7.2 |
| 搖瓶培養(yǎng)基 | 1.0 | 1.0 | 0.2 | / | 7.2 |
| 斜面培養(yǎng)基 | 1.0 | 1.0 | 0.2 | 2.0 | 7.2 |
(3)器材：注射器(5Ml)、針頭(5號、12號)、剪刀、膠布、紗布、離心管、止血鉗、刀片、l0mL吸管、帶橡皮塞無菌試管、平皿、接種環(huán)、100mL三
角瓶(帶橡皮塞)、量筒、小動物解剖臺、青霉素瓶、鑷子、甲醛、碘酒棉球、酒精棉球、干棉球、麥氏比濁管、生理鹽水等。
(四)實驗方法
(1)抗原制備：
1)鞭毛(H)抗原制備 將庫斯塔克亞種、蠟螟亞種(青蟲菌)、加拿大亞種及分離的蘇云金芽胞桿菌從砂土管或斜面移接到牛肉膏蛋白胨斜面上培養(yǎng)1夜，再用稀釋分離法或劃線分離法獲得單個菌落，按種于平板的軟瓊脂培養(yǎng)基的中央，30℃培養(yǎng)1夜(9-12h)。當運動性細菌擴散到距離平板邊緣數毫米時，用接種環(huán)取*外邊菌體。再接種于另一軟瓊脂平板的中央。如上法培養(yǎng)，再接種于第三個軟瓊脂平板。如此移接4-6次，*后一次則取*外邊菌體接種子搖瓶(500mL三角瓶，裝搖瓶培養(yǎng)基50mL)中，28—30℃振蕩培養(yǎng)10-14h。培養(yǎng)液離心(3000 r/min，15min)，去上清液，再懸浮于50mL含0.25％的福爾馬林生理鹽水中，再離心15min，去上清液，將收集的菌體懸浮在10mL含0.25％福爾馬林生理鹽水中，制成抗原母液，置冰箱保存?zhèn)溆?若發(fā)現(xiàn)自發(fā)凝集則棄去不用)，保存抗原液使用期為4周。(說明：由于蘇云金芽胞桿菌為周生鞭毛菌，鞭毛多且長，將菌體緊密地包裹著，用此法制備的抗原即代表H抗原。免疫動物后即產生相應的鞭毛抗體)。
2)菌體抗原制備 將鞭毛抗原母液分出一半，裝入帶棉塞的無菌空試管中，置沸水中加熱1h，待冷卻后即為去掉鞭毛的菌體抗原。放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/div> 
(2)免疫家兔：
免疫前從家兔身上采集少量血液，作為對照血清(采集方法和靜脈注射相似，將兔子固定，用注射器針頭對準耳朵邊緣靜脈末梢附近插入慢慢抽出血液約3mL，分離血清)。
用鞭毛或菌體抗原免疫的注射程序如下：
時間 劑量 途徑
第1天 0.5ml(濃度為麥氏比濁管第7管) 耳靜脈
第5天 1.0mL 耳靜脈
第9天 1.5mL 耳靜脈
第13天 2.0ml 耳靜脈
第17天 2.5mL 耳靜脈
(3)采試血：
注射*后一次一周后采試血約3mL，方法同采對照血清。當試血效價達到1：2000以上，則可采全血，否則要加強注射1-2次。
(4)采全血：
采全血主要有以下兩種方法：
1)心臟采血 采血當天早上不喂飼料。采血時由助手用左手緊抓兔頸部及兩只前腿，右手握兔的后肢，使免仰臥。腹部向上，固定(或將兔固定在小動物解剖臺上)。用剪刀剪去左前胸的毛，用左手在兔肋骨左側探得心臟搏動*劇烈處，然后用碘酒棉球消毒、再用酒精棉球洗脫碘酒，右手執(zhí)注射器針頭(50mL注射器，12號針頭，注射器與針頭用3.5cm長的硅膠管連接)由該處刺入。若部位準確，則可見到心血涌入注射器中。徐徐抽取血液，達足量時(50mL左右)，由與硅膠管連接處取下注射器．慢慢注入已準備好的寫有標簽的無菌三角瓶或平皿中。注完后將三角瓶斜置，同時將注射器再連接到硅膠管上，再接著抽血，直到抽完。一只2kg以上的兔可抽血100mL以上。
2)頸動脈放血
將家兔固定在小動物解剖臺上，腹部向上，用剪刀剪去頸部的毛．面積盡量大些。再用酒精消毒后，將頸部皮膚捏起來，從根部開始剪開直至鎖骨間。弄破肌膜，讓氣管暴露，在氣管兩側各有—根近乎桃紅色的頸動脈管。手觸之即可感到脈動。用鑷子小心撥開頸動脈周圍的肌肉和神經，然后拉出動脈。用絲線系住遠心端c處（圖1）。在離此處約1cm的近心端處夾上一個止血鉗a，再在離a約2M的近心端夾上一個止血鉗b，在a、b間開一小口，于遠心端c與a之間剪斷動脈，用止血鉗a將動脈管小口引入三角瓶內，然后放開止血鉗b，血流便由小口流入三角瓶內。注意開始血流得不要太快，以免兔子很快衰弱，使全血量減少。放血至三角瓶3-4cm高，在b處夾住血管，并將盛血三角瓶塞上橡皮塞斜置。同時再取一個三角瓶同上法繼續(xù)放血．血流減弱時，可用力壓迫家兔的腹
部，血液短時間即可涌出。也可由另一側的頸動脈如上法采血，直至采完。
圖1 頸動脈放血示意圖
采血后的注意事項：由于血液會立即凝固，因此，采血后的注射器和針頭要
立即用生理鹽水抽吸幾次．并將取下的針頭和簡芯連同剪刀、止血鉗、鑷子等一起泡進生理鹽水中，洗凈后煮沸消毒備用。 (5)抗血清的分離、保存：將三角瓶的血液斜置0.5-1h后(室溫或37℃溫箱)，再將三角瓶立起，并用無菌細玻棒沿瓶壁將血塊與瓶壁分離，轉入冰箱過夜，讓血清充分析
出，用無菌吸管和毛細滴管分出血清。若血清中帶有紅血球，則須裝入無菌離心管中離心(3000 r/min ，20min)。將血清吸入無菌三角瓶，去掉
紅血球。按1:100的比例加入1％的硫柳汞或5％的疊氮納，即*終濃度分別為0.01％和0.05％。將血清分裝入青霉素瓶(或安碚瓶)，用膠布將口
封住(或將安碚瓶火焰封口)，貼上標簽，注明抗血清的名稱、效價及制備日期．置－20℃保存?zhèn)溆谩?p class="MsoNormal" style="margin: 0cm 0cm 0pt">以上資料由www.xiangyikj.com 長沙駿逸實驗儀器有限公司轉載提供，供您學習參考！長沙駿逸儀器有限公司是專業(yè)生產制造離心機、實驗室儀器的高科技企業(yè)。
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