無菌操作基本技術(shù)
  1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺laminar flow 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %
ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實驗操作。每
次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間
污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間
隔應讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
  2. 無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦
拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操
作。
  3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打
開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，
盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
  4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒
感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺至少Class II。操作過程
中，應避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳
針頭之傷害等。
  5. 定期檢測下列項目：
  5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
  5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染水盤的水用無菌水，每周更換。
  5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(wǎng)300
小時/預濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA。
  6. 水槽可添加消毒劑Zephrin 1:750，定期更換水槽的水。

實驗用品
1. 種類︰
1.1. 細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌
制品。
1.2. TC 級培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask,
plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene PP 為不透
明材質(zhì)，polystyrene PS 為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。
1.6. 玻璃血清瓶Pyrex or Duran glassware：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml
2. 清洗︰
2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。
2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干
凈，勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌︰
3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘，置于
oven 中烘干。
3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170 oC, 4 小時。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液次氯酸，即漂白水 或是蒸汽高
壓滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘處理。

培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 oC 冰箱，避免光照，實驗進行前放在37 oC 水槽中溫熱。
2. 液體培養(yǎng)基加血清 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，
可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制以1 升為例：
3.1. 細胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為
7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成
pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合，
然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強酸HCl或強堿NaOH，因為氯離子對細胞生
長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。
3.2. 材料：
3.2.1. 純水milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要
3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
3.2.3. NaHCO3 Sigma S-4019
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一溶于200ml
milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合�；旌�
溶液之pH 應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。
若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，
pH 會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養(yǎng)
基種類、日期、瓶號等，貯存于4 oC。血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。
4. 配制培養(yǎng)基之生長測試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell ATCC CCL-34 或CCRC 60004
4.1.2. 6-well TC plate or 35 mm TC dish
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution GibcoBRL 10092-013

4.2. 步驟：
4.2.1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate 或35
mm TC dish 中，每個well 接種1 × 102 活細胞，同時作對照組實驗。
4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群
落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。
4.2.3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液甲醇：冰醋酸﹦ 3:1，室溫下靜
置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不
佳，則丟棄之。

抗生素
1. 細胞庫之細胞培養(yǎng)基不加抗生素
1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進之細胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。
1.2. 培養(yǎng)自其它實驗室引進之細胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待
token freeze 通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。
2. 寄送活細胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個flask 時，則須添加抗生素penicillin 100 units/ml +
streptomycin 100 ug/ml。
3. 若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會抑制
mycoplasma 生長。
4. 去除細菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin
250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。
5. 抗生素使用種類與濃度：
工作濃度. 儲存溫度. 殺滅細菌
penicillin 100 units/ml -20℃ G+ bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G+G- bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G+G- bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G+G- bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeastmolds
nystatin 50 ug/ml -20℃ yeastmolds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeastmolds

血清
1. 血清必須貯存于–20 ～ -70 oC，若存放于4 oC，請勿超過一個月。如果一次無法用完一
瓶，可將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時體積會增加約10 %，
必須預留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。
2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加
入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。
3. 瓶裝500ml 血清解凍步驟逐步解凍法: -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室
溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖
晃均勻小心勿造成氣泡，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20 oC 直接
至37 oC 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。
4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均
勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份complement 去活化。除非必須，一般不建
議作此熱處理，因為會造成沈淀物之顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。補體參與之反應有：
cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells
platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxisactivation of lymphocyticmacrophage cell
type。
5. 勿將血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較
不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。
6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白lipoprotein 變性
及解凍后血清中存在之血纖維蛋白fibrin 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本
身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上
清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會
阻塞過濾膜。
6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。
有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為血清遭受污染，而將血清
放在37 oC 中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37 oC 環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更
會誤認為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此
小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應立即停用，更換另一批
號的血清。
7. 血清之生長測試
7.1. 材料：
7.1.1. MDCK cell ATCC CCL-34 或CCRC 60004
7.1.2. a-MEM alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022
7.1.3. 6-well TC plate or 35mm TC dish
7.1.4. methanol
7.1.5. glacial acetic acid
7.1.6. 10 % Giemsa solutionGibcoBRL 10092-013
7.2. 步驟：
7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS 已測試過 培養(yǎng)MDCK 細胞于T75 flask 至80
% confluency。
7.2.2. 以trypsin-EDTA 處理細胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM 制成細
胞懸浮液，并測細胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM 稀釋細胞濃度為1×102 活
細胞數(shù)/ ml。
7.2.3. 將1 ml 細胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同濃度的血
清20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 % 之a(chǎn)-MEM，使血清*終濃度為10
% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。
7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細胞群落大
到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。
7.2.5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液甲醇:冰醋酸﹦ 3:1，室溫下靜
置10 min。
7.2.6. 去除固定液，水洗二次。
7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
7.2.8. 去除染液，水洗二次。
7.2.9. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)
7.2.10. 計算SPE Serum Plating Efficiency ：
SPE = no. of colonies / well / 100 x 100 %
7.2.11. 計算RPERelative Plating Efficiency：
SPE = [ total colonies of six well test / Total colonies of six well control ] x100 %
7.3. 比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測血清對細胞生長的影響。
7.4. 訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置于–70 oC 保存之

冷凍細胞活化
1. 冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死
亡。
2. 細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常例如產(chǎn)生
單株抗體或是其它蛋白質(zhì)。
3. 材料
3.1 37 oC 恒溫水槽
3.2 新鮮培養(yǎng)基
3.3 無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶
3.4 液氮或干冰容器
4. 步驟：
4.1 操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時
蓋子易松掉。
4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無
菌操作臺內(nèi)。
4.4 取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全
部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。
4.5 取出0.9 ml 解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)稀釋比例為
1:10～1:15，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細胞懸浮液作
存活測試。
4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護劑例如DMSO 或glycerol，依細胞種類而異，
一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞
懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清
液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

細胞傳代培養(yǎng)
1. 細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細胞
種類而異。
2. 材料：
2.1. 無菌磷酸生理緩沖液Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS,
GibcoBRL 21600-010
2.2. trypsin-EDTA solution 0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062：
以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽
回溫。
2.3. 新鮮培養(yǎng)基
2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶
3. 步驟：
3.1. 附著型胞adherent cell
3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。
3.1.2. 用D-PBS 洗滌細胞一至二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液1ml/25cm2, 2ml/75cm2，37 oC 作用數(shù)分鐘，于倒
立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶
液。若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清
之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。
3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)
次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常
培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.2. 懸浮型細胞suspension cell
3.2.1. 吸出細胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。
3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的
培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.3. 融合瘤hybridoma
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可
能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基
稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。

原創(chuàng)作者：長沙駿逸實驗儀器有限公司