Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化淋巴細胞和淋巴母細胞

一　原理

　　Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低<20mosm／kg H２O, 粘度也很小，可形成高達1.3g／ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時可在低離心力200～1000g于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達到滿意的細胞分離結(jié)果。由于Percoll擴散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。

　　二操作方法及注意事項

　　1.不同濃度密度Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達到生理性滲透壓，然后用生理溶液0.85％ NaCl或0.15M PBS稀釋到所需濃度。

　Percoll濃度％　　70　　　　60　　　　50　　　　40　　　　30　　　　　20

　　比重g／ml　　 　1.090     1.077     1.067     1.056     1.043       1.031

   2.　不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。

　　3.　裝樣：樣品體積和細胞濃度根據(jù)不同細胞而異，一般加樣體積不宜過大，細胞濃度也不可過高，否則會影響細胞的分離和回收。

　　4.　離心：一般采用離心力為400g，時間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機加速、降速時要慢，要平穩(wěn)。

　　5.　取樣：當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測用。

　　三分離純化細胞舉例

　　1.　富含NK活性大顆粒淋巴細胞LGL的純化:按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如用10ml試管或塑料管分離,每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從外周血中分離的PBMC細胞1×10８懸于１ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。

　　2.　純化淋巴母細胞和除去死細胞：分別疊加50％和30％Percoll液。收取經(jīng)PHA或其它抗原、有絲分裂原刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC如腎綜合征出血熱患者，按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為小淋巴細胞；兩層Percoll之間為淋巴母細胞，純度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可進行表型、結(jié)構(gòu)以及功能的研究。

　　四　人不同血細胞的漂浮密度

　　　　　　　　　　表　　　人不同血細胞的漂浮密度

　　　──────────────┬──────────────────

　　　細　胞　　　漂浮密度　　　　│ 細　胞　　　　　　　漂浮密度

　　　──────────────┼──────────────────

　　　紅細胞　　1.09-1.11　　　　│淋巴細胞　　　　　　　1.052-1.077

　　　粒細胞　　　　　　　　　　 │ B淋巴細胞　　　　　 1.062-1.075

　　　嗜酸性　　1.09-1.095　　　 │ T淋巴細胞　　　　　 1.065-1.077

　　　嗜中性　　1.080-1.085　　　│ 淋巴母細胞　　　　　1.065-1.077

　　　單核細胞　1.050-1.066　　　│自然殺傷細胞　　　　　1.050-1.070

　　　血小板　　1.030-1.060　　　│

　　　──────────────┴──────────────────

Percoll Gradient

Contributor: Suprya Jayadev


Forming gradient

1 Add 22 ml of light Percoll to a centrifuge tube.

2 Using a 20 G 3 1/2 in spinal needle on a 10 cc syringe, carefully underlay with 6 ml of dense Percoll.

3 Centrifuge tubes at 48,000xg ~20,000 rpm in JA-20 rotor in Beckman J2-21 high speed centrifuge for 15 mins, 40C.

Fractionation

4 Carefully layer supernatant on top of the preformed gradient; without disrupting the gradient!!

－－> In addition to gradient containing sample, should also run a marker gradient loaded with colored marker beads of known density Pharmacia.

5 Centrifuge samples at 48,000xg , 40C, 15 mins, as before.

6 Collect 1 or 2 ml fractions at 40C by aspiration from the bottom of the gradients through a pipet tip attached to polyethylene tubingperistaltic pump.


Removing Percoll

7 Should have collected 19 or 38 fractions into 5/8 X 3 in,10.4 ml capacity centrifuge bottles Beckman # 355603 during the previous step.

－－> Determine the distances of bead migration in the marker gradient.

8 Weight balance tubes using Percoll balancing solution.

9 Centrifuge fractions at 180,000xg ~60,000 rpm using the 70.1 Ti rotor in the Beckman L7-65 ultracentrifuge for 30 minutes.

－－> or at 100,000xg for 90 minutes

10 Collect supernatantsdiscard pellets.

 

Reagents:

Relaxation buffer without EGTA:
100 mM KCl
3 mM NaCl
1 mM ATPNa2
3. 5 mM MgCl2
10 mM PIPES pH 7.3

Light Percoll final density 1.040 g/ml
10 ml 10X relaxation buffer with EGTA
26.4 ml undiluted Percoll density 1.130
63.6 ml dH2O
－－> relaxation buffer makes Percoll isotonic
－－> relaxation buffer should contain 12.5 mmol/l EGTA

Dense Percoll final density 1.120 g/ml
3 ml 10X relaxation buffer with EGTA
26.4 ml undiluted Percoll
0.60 ml dH2O

Percoll balancing solution final density 1.122 g/ml
5 ml 10X relaxation buffer with EGTA
45 ml undiluted Percoll

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