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技術(shù)文章
活性氧檢測試劑盒說明書
中文名稱
活性氧檢測試劑盒
英文名稱
Reactive Oxygen Species Assay Kit
規(guī)格：100次～500次
貯存條件：-20°C干燥避光保存
保質(zhì)期：12個月
活性氧檢測試劑盒
產(chǎn)品組成：
產(chǎn)品編號 產(chǎn)品名稱 包裝
A液 DCFH-DA(10mM) 0.1ml
B液 活性氧陽性對照(Rosup, 50mg/ml) 1ml
— 說明書 1份
產(chǎn)品簡介：
活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一種利用熒光探針DCFH-DA 進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH 不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH 生成有熒光的DCF。檢測DCF 的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。
本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，以便于活性氧的檢測。Rosup 是一種混合物，濃度為50mg/mL。
本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。
本試劑盒可以測定100～500 個樣品。
使用說明：
1. 裝載探針
對于刺激時間較短(通常為2小時以內(nèi))的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對于細(xì)胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細(xì)胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，
通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1mL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通�；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ�(xì)胞20～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3～5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通�；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ�(xì)胞20～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。
2. 檢測
對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。對于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
3. 參數(shù)設(shè)置
使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點(diǎn)檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。
4. 其它說明
陽性對照可以按照1∶1000的比例使用。例如裝載好探針的細(xì)胞共1mL，可以加入1μL的陽性對照刺激。
通常刺激后20～30分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細(xì)胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對照的濃度。
另外，對于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1∶2000～1∶5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA的濃度為2～5μmol/L。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15～60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。
活性氧陽性對照(Rosup)僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。
保存條件：
-20℃避光保存，有效期一年。
注意事項：
1. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。
2. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情
況是否良好。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考上圖。
3. 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間(刺激時間除外)，以減少各種可能的誤差。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
原創(chuàng)作者：上海一基實業(yè)有限公司
