這是一個(gè)與 mRNA 結(jié)合的細(xì)菌核糖體的分子模式圖，該核酸蛋白復(fù)合體正在合成蛋白質(zhì)。

科研試劑供應(yīng)商-（www.qiyibio.com齊一生物

隨著科研人員逐漸揭開(kāi) RNA 修飾的奧秘，幫助我們了解表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)（epitranscriptomics）的工具也變得越來(lái)越多了。

2004 年，以色列特拉維夫大學(xué)（Tel Aviv University in Israel）的腫瘤學(xué)家 Gideon Rechavi 等人將當(dāng)時(shí)能夠找到的所有人類基因組 DNA 序列與對(duì)應(yīng)的 mRNA 進(jìn)行了比對(duì)。他們希望找到 mRNA 序列里的腺嘌呤（adenosine, A）轉(zhuǎn)換成次黃嘌呤（inosine, I）的信號(hào)。這種 A 到 I 的轉(zhuǎn)換會(huì)改變蛋白質(zhì)的編碼序列，對(duì)于我們?nèi)祟惗�言，這是保證天然免疫系統(tǒng)正常功能的關(guān)鍵因素。據(jù) Rechavi 回憶，這項(xiàng)工作聽(tīng)起來(lái)簡(jiǎn)單，但實(shí)際上非常復(fù)雜。好多個(gè)研究小組都曾作出嘗試，但結(jié)果都以失敗告終。這主要是因?yàn)楫?dāng)時(shí)的測(cè)序技術(shù)還不太發(fā)達(dá)，會(huì)產(chǎn)生很多錯(cuò)誤的測(cè)序結(jié)果，比如單堿基突變結(jié)果，進(jìn)而帶來(lái)了很大的數(shù)據(jù)噪聲。但是 Rechavi 等人使用了新的生物信息學(xué)工具，所以成功地在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè) A—I 轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，而一個(gè)細(xì)胞，或者物種的所有 mRNA 其實(shí)也就這么多。后續(xù)的研究又陸續(xù)將這些 A—I 轉(zhuǎn)換位點(diǎn)的數(shù)量增加到了數(shù)百萬(wàn)個(gè)。

發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤轉(zhuǎn)換算得上是一種特例，因?yàn)榭蒲腥藛T只需將 DNA 序列與 RNA 序列進(jìn)行比對(duì)，就能夠輕易地發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)。但是在 mRNA 的序列里，至少有 1/4 的核酸（A、C、G、U）是攜帶有化學(xué)修飾物的（我們將 DNA 序列里的這種修飾稱作表觀遺傳學(xué)修飾），只不過(guò)現(xiàn)有的測(cè)序手段無(wú)法發(fā)現(xiàn)這些修飾物�？蒲腥藛T也不知道這些修飾物會(huì)給 RNA 帶來(lái)怎樣的改變，因此他們正在努力解決這個(gè)問(wèn)題。

近五年來(lái)，學(xué)界掀起了一股研究 RNA 表觀遺傳學(xué)修飾的熱潮，很多課題組都將目光集中在 N6 - 甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）這個(gè)核酸分子上。大家都在研究全轉(zhuǎn)錄組水平上的這種化學(xué)修飾，以及該修飾與人體健康和疾病的關(guān)系。但該研究面臨的問(wèn)題也是非常大的，因?yàn)檫@種修飾不僅發(fā)生在 mRNA 分子上，同時(shí)也發(fā)生在其它 RNA 分子上，幾乎涉及到了生命科學(xué)的所有領(lǐng)域，連病毒的 RNA 都會(huì)發(fā)生這種修飾。

其實(shí)這些修飾本身并不新奇。我們現(xiàn)在之所以這么關(guān)注這種修飾的意義，這么關(guān)注所謂的表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)，是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了與這些修飾有關(guān)的酶，并且對(duì)這些酶也有了一定的認(rèn)識(shí)和理解。2010 年，美國(guó)芝加哥大學(xué)（University of Chicago, Illinois）的化學(xué)家 Chuan He 提出，這種化學(xué)修飾反應(yīng)是可逆的，而且對(duì)于基因表達(dá)調(diào)控具有非常重要的作用和意義。不久之后，He 的課題組個(gè)發(fā)現(xiàn)了 mRNA 化學(xué)修飾去除酶——FTO。該發(fā)現(xiàn)意味著 m6A 不只是一個(gè)被動(dòng)的修飾物，細(xì)胞也可以逆轉(zhuǎn)這種修飾反應(yīng)，即 mRNA 的化學(xué)修飾是可以由細(xì)胞來(lái)操控的。與此同時(shí)，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，我們將能更方便地開(kāi)展全基因組范圍內(nèi)的測(cè)序，也讓全轉(zhuǎn)錄組修飾（m6A 等）研究成為可能。

這就是一個(gè)甲基化修飾過(guò)的 RNA 分子，圖中淺藍(lán)色表示的就是 m6A。

今天，表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究正在蓬勃開(kāi)展，不過(guò)相關(guān)的技術(shù)仍然不夠完善，還需要繼續(xù)開(kāi)發(fā)。比如目前的技術(shù)在靈敏性（sensitivity）上就尚有不足，無(wú)法對(duì)少量的、稀有的樣本開(kāi)展研究、無(wú)法對(duì)轉(zhuǎn)錄組修飾開(kāi)展定量研究，并且無(wú)法通過(guò)一次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多種不同的修飾等。美國(guó)芝加哥大學(xué)（University of Chicago）的分子生物學(xué)家 Tao Pan 也參與了 He 等人發(fā)現(xiàn) FTO 的工作，他認(rèn)為現(xiàn)在*需要的是能夠檢測(cè)所有 RNA 修飾物的技術(shù)。

不過(guò)這也說(shuō)明，從事表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的科研人員對(duì)于他們正在鉆研的這個(gè)領(lǐng)域還是非常熱衷的。美國(guó)紐約 Weill Cornell 醫(yī)學(xué)院（Weill Cornell Medical College in New York City）的遺傳學(xué)家 Chris Mason 曾經(jīng)領(lǐng)導(dǎo)過(guò) m6A 的作圖工作，她認(rèn)為這就好像人們?cè)谙胫?DNA 時(shí)，一定也在想著 DNA 的折疊過(guò)程，或者 DNA 的表觀遺傳學(xué)修飾過(guò)程。Mason 相信，現(xiàn)在，或者說(shuō)在不久的將來(lái)，人們?cè)谙胫?RNA 的時(shí)候，肯定也會(huì)同時(shí)想到它們的修飾過(guò)程。

早在上世紀(jì)七十年代初，科學(xué)家們就發(fā)現(xiàn) mRNA 存在化學(xué)修飾的現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)使用的試驗(yàn)技術(shù)是對(duì) m6A 進(jìn)行放射性標(biāo)記。但是因?yàn)檫@些試驗(yàn)都是通過(guò) mRNA 3’端多聚腺嘌呤尾高選擇性技術(shù)來(lái)富集 mRNA 分子的，所以科研人員們擔(dān)心這會(huì)摻雜進(jìn)其它種類的 RNA。據(jù)美國(guó) Weill Cornell 醫(yī)學(xué)院的化學(xué)生物學(xué)家 Samie Jaffrey 介紹，正是因?yàn)檫@個(gè)原因，讓他們無(wú)法確定 mRNA 里是否還存在其它 RNA，以及是否發(fā)生了‘污染’，因此都放棄了這種試驗(yàn)方案。

另一個(gè)難題就是確定 mRNA 里哪些位點(diǎn)發(fā)生了 m6A 修飾，這些信息能夠幫助我們了解這些基因的功能。傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)會(huì)用到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，即將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的 cDNA，然后再對(duì) cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序�？墒沁@些逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)去除 mRNA 上的修飾物。對(duì)此，Jaffrey 指出，所以我們根本看不到 m6A，只能看到‘未修飾的’A。

不過(guò)雖然存在這些技術(shù)上的障礙，我們還是在細(xì)菌的 RNA 上發(fā)現(xiàn)了一些修飾現(xiàn)象，這也引起了 Jaffrey 的興趣，她決定看看在哺乳動(dòng)物的 RNA 里是否也存在這種修飾現(xiàn)象。

Jaffrey 和 Mason 一起，首先將 RNA 分子切成一個(gè)、一個(gè)的小片段，然后用含有特異性針對(duì) m6A 的抗體對(duì)這些 RNA 片段進(jìn)行洗脫，*后對(duì)富集后含有 m6A 修飾物的 RNA 分子測(cè)序。據(jù) Jaffrey 介紹，通過(guò)這種方法，她們清楚地看到了 mRNA 上的修飾物，而且完全沒(méi)有其它 RNA 的污染。Rechavi 的課題組也通過(guò)類似的方法發(fā)現(xiàn)了大量的 m6A 修飾位點(diǎn)，他們?cè)谌祟?7000 多個(gè)基因里一共發(fā)現(xiàn)了將近 12000 個(gè) m6A 修飾位點(diǎn)。這些位點(diǎn)主要都位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)（外顯子）內(nèi)，或者終止密碼子內(nèi)。

目前，這些名為 m6A-seq 和 MeRIP-seq 的研究方法已經(jīng)被人們廣泛采用，以用于對(duì)各種疾病或器官的 m6A 開(kāi)展相關(guān)研究。目前，人們可以很方便地獲得特異性識(shí)別 m6A 的抗體和試劑，比如 Active Motif （go.nature.com/2kqgzu8）、MilliporeSigma （go.nature.com/2kw39m3） 和 New England BioLabs （go.nature.com/2kqjjaz） 等公司都提供這類科研試劑�？蒲腥藛T們相信，這些 RNA 修飾會(huì)參與細(xì)胞分化過(guò)程的調(diào)控，而該過(guò)程出現(xiàn)錯(cuò)誤就會(huì)導(dǎo)致腫瘤，因此 RNA 修飾很可能與腫瘤有關(guān)。實(shí)際上，我們也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了表觀轉(zhuǎn)錄組與腫瘤之間的聯(lián)系。比如 He 等人就發(fā)現(xiàn)，某些急性粒細(xì)胞白血�。╝cute myeloid leukaemia）的病人，體內(nèi) FTO 的含量就明顯高于正常水平，因此很多 m6A 位點(diǎn)都被去修飾了，這就有可能促使細(xì)胞發(fā)生分化。

但是 Jaffrey 等人做的另外一個(gè)同樣的研究則獲得了完全相反的結(jié)果。該研究使用的是 miCLIP 技術(shù)，該技術(shù)的分辨率更高。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，m6A 抗體也能夠與另外一種化學(xué)修飾物——N6，2 - 氧 - 二甲基腺苷（N6, 2?-O-dimethyladenosine, m6Am）結(jié)合。M6Am 主要見(jiàn)于 mRNA 5’帽子結(jié)構(gòu)處。不過(guò) Jaffrey 當(dāng)時(shí)并不清楚這種修飾有什么具體的生物學(xué)意義�，F(xiàn)在他們已經(jīng)知道，m6Am 才是 FTO 的作用靶點(diǎn)，而不是 m6A。M6Am 會(huì)影響 mRNA 的穩(wěn)定性，及其在細(xì)胞內(nèi)的定位。再結(jié)合上 He 之前的研究成果，這提示我們，m6Am 與急性粒細(xì)胞白血病的發(fā)病和發(fā)展有關(guān)。

美國(guó)斯坦福大學(xué)（Stanford University, California）的腫瘤生物學(xué)家 Howard Chang 認(rèn)為，這些現(xiàn)象都是一個(gè)新興研究領(lǐng)域里非常常見(jiàn)的，這與組蛋白修飾研究領(lǐng)域早期的發(fā)展?fàn)顩r（當(dāng)時(shí)的矛盾情況更加突出）還不太一樣。

腫瘤生物學(xué)家 Howard Chang

其它 RNA 化學(xué)修飾也引起了科研人員的注意。2016 年，由中國(guó)北京大學(xué)（Peking University）的化學(xué)家 Chengqi Yi 和 Rechavi 與 He 共同領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)課題小組使用抗體技術(shù)，對(duì)小鼠和人的細(xì)胞系，以及組織進(jìn)行了 N1 - 甲基腺苷（N1-methyladenosine, m1A，早在上世紀(jì) 60 年代初就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這種化學(xué)修飾物）的作圖研究。他們使用了多種不同的方法，來(lái)防止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)干擾 RNA 中的 m1A。他們都發(fā)現(xiàn)，m1A 位于 mRNA 的翻譯起始位置。應(yīng)激條件會(huì)改變 m1A 的位置，這也說(shuō)明這種化學(xué)修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控的過(guò)程。

雖然科研人員們還不太清楚 m1A 的具體作用，但是他們已經(jīng)找到了一條比較有意思的線索，即絕大多數(shù) RNA 都只含有一個(gè) m1A 位點(diǎn)，而且這些被修飾過(guò)的位點(diǎn)的翻譯頻率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它未修飾的位點(diǎn)。據(jù) Rechavi 介紹，這一點(diǎn)讓他們非常興奮，當(dāng)然也是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)樗麄兗磳⒚鎸?duì)的是一套全新的 mRNA 翻譯調(diào)控機(jī)制。目前，人們可以在 MBL International （go.nature.com/2kvqpfs） 等地購(gòu)買到特異性識(shí)別 m1A 的抗體。

其它全轉(zhuǎn)錄組化學(xué)修飾研究策略主要利用的就是某些 RNA 修飾物能夠與其它化學(xué)標(biāo)簽結(jié)合的特性。Yi 在 2011 年末建立自己的實(shí)驗(yàn)室時(shí)，大家已經(jīng)非常清楚，在其它 RNA 里含有很多修飾過(guò)的 RNA 組成核酸——假尿嘧啶（pseudouridines，pseudoUs），但是在 mRNA 里還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)過(guò)這些核苷。2015 年，Yi 的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一種化學(xué)標(biāo)記和洗脫方法，可用于富集 mRNA 上的化學(xué)修飾物。出乎預(yù)料的是，他們?cè)谌撕托∈蟮?mRNA 中，發(fā)現(xiàn)了大量的假尿嘧啶，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了預(yù)期。于是他們開(kāi)始專注于研究這些化學(xué)修飾物的功能。Yi 等人認(rèn)為，mRNA 里的假尿嘧啶可能具有多重功能，這取決于它們?cè)谑裁磿r(shí)候、什么位置、如何出現(xiàn)，以及是如何對(duì) RNA 進(jìn)行調(diào)控的。目前人們也發(fā)現(xiàn)了很多假尿嘧啶寫(xiě)入因子，但是還不清楚是否存在假尿嘧啶擦除因子和識(shí)別因子。

不論是使用抗體還是化學(xué)標(biāo)記的方法，發(fā)現(xiàn) RNA 中化學(xué)修飾的位置都是一項(xiàng)非常麻煩的工作。比如，使用抗體時(shí)會(huì)面臨交叉反應(yīng)的問(wèn)題，因此，科研人員必須使用 2 種以上的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而且還得進(jìn)行交叉驗(yàn)證。而使用化學(xué)標(biāo)記方法又有可能更傾向于切斷、并結(jié)合和富集某些特定的 RNA 片段，而帶來(lái)偏倚。據(jù) Yi 介紹，測(cè)序深度和所使用的生物信息學(xué)軟件也會(huì)影響影響我們發(fā)現(xiàn) RNA 修飾位點(diǎn)的工作。此外，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間也會(huì)影響 RNA 的修飾水平。鑒于此，Mason 認(rèn)為，獲得一個(gè)基準(zhǔn)的參考圖譜非常重要。

但是在任何時(shí)候，僅僅只知道某個(gè) RNA 分子上有哪一種化學(xué)修飾是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。我們還需要對(duì)所有的 RNA 修飾進(jìn)行定量分析，這也是非常重要的工作。Pan 指出，因?yàn)榧?xì)胞也許就是依靠一定量的 RNA 修飾，才能夠行駛某種功能。對(duì)于那些希望通過(guò)激活 RNA 修飾相關(guān)蛋白來(lái)調(diào)控 RNA 修飾水平的科研人員而言，這種修飾定量信息尤為重要。據(jù) Pan 介紹，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這些 RNA 修飾相關(guān)蛋白，這提示細(xì)胞對(duì) RNA 修飾進(jìn)行精密調(diào)控的重要性。

2015 年，Pan 的課題組提出了關(guān)于 RNA 修飾水平的定量研究策略，至少可用于 tRNA 的修飾研究工作。該策略采用了一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，能夠以較高的效率通讀待測(cè) RNA 分子，哪怕 RNA 分子中有很多位點(diǎn)已經(jīng)發(fā)生了化學(xué)修飾，也不影響該逆轉(zhuǎn)錄酶的效率。這樣一來(lái)，他們就可以獲得全長(zhǎng) RNA 序列了。Pan 的課題組就正在用這種策略研究 mRNA 的 m1A 修飾問(wèn)題。

但是，可能*快速了解這些化學(xué)修飾物功能的方法就是發(fā)現(xiàn)它們的識(shí)別因子（readers）、寫(xiě)入因子（writers）和擦除因子（erasers）。2012 年，他們?cè)谧?m6A 研究時(shí)就創(chuàng)造了用已修飾和未修飾的短 RNA 片段的富集方法。當(dāng)時(shí)他們使用這些短 RNA 片段做 “誘餌”，來(lái)釣取與這些 RNA 相結(jié)合的蛋白因子。2014 年，他們課題組又使用類似的策略發(fā)現(xiàn)了好幾個(gè) m6A 識(shí)別因子。其他的研究也發(fā)現(xiàn)了這些 RNA 的其它細(xì)胞內(nèi)作用。現(xiàn)在，Rechavi 準(zhǔn)備嘗試用這種“釣魚(yú)” 策略來(lái)研究 m1A。不過(guò)由于 m1A 的位置更加集中于翻譯起始位點(diǎn)，該處的分子結(jié)構(gòu)更加緊密，所以實(shí)驗(yàn)難度可能會(huì)更大。

一旦我們發(fā)現(xiàn)了能夠識(shí)別某種化學(xué)修飾物的因子，那么就可以很容易地通過(guò)基因編輯技術(shù)來(lái)調(diào)控該因子的表達(dá)，從而幫助科研人員從全局的角度去發(fā)現(xiàn)化學(xué)修飾改變的跡象。比如，Chang 就通過(guò)去除某個(gè) m6A 修飾酶的方法，證明了該修飾作用對(duì)于細(xì)胞的命運(yùn)具有決定性的意義。

但是隨著表觀遺傳學(xué)涉及的范圍越來(lái)越廣，從 DNA 擴(kuò)展到 RNA，如何認(rèn)識(shí)和理解這些核酸上的化學(xué)修飾的功能變成了一個(gè)大難題，比如同一個(gè)酶可能會(huì)作用于好多種不同的 RNA，同一種化學(xué)修飾在不同的 RNA 上也可能會(huì)發(fā)揮不同的功能。Chang 表示，如果有一天我們發(fā)現(xiàn)，有一些功能是通過(guò)其它我們還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的 RNA 來(lái)行使的，他一點(diǎn)都不會(huì)覺(jué)得奇怪。

這是一幅 DNA 分子上結(jié)合了 RNA 聚合酶的復(fù)合體的電鏡照片。

近幾年，He 的課題組又發(fā)現(xiàn)，RNA 修飾是一種轉(zhuǎn)錄子調(diào)控機(jī)制，它參與了細(xì)胞內(nèi)多種不同的作用，比如啟動(dòng)細(xì)胞分化程序等。因此，科研人員們迫切需要更多、更好的新技術(shù)，來(lái)探索這方面的奧秘。去年 10 月，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）給 He 和 Pan 提供了一個(gè)為期五年，總金額為 1060 萬(wàn)美元的資助，以幫助他們建立一個(gè)新中心，用于開(kāi)發(fā)與 RNA 修飾研究有關(guān)的新技術(shù)。其中有一項(xiàng)任務(wù)就是找到一種在修飾位點(diǎn)引入突變，并且大量擴(kuò)增這些突變的方法。

由于有了新的影像學(xué)技術(shù)，所以我們有可能在肉眼直視（visual inspection）下看到某個(gè) RNA 分子上的修飾物。據(jù) He 介紹，他非常想向大家介紹，已經(jīng)有人開(kāi)發(fā)出了能夠直接對(duì) mRNA 分子上的 m6A 修飾物進(jìn)行成像的技術(shù)。不過(guò)當(dāng)時(shí)的情況還不是那樣的。Ye Fu 之前曾經(jīng)在哈佛大學(xué)（Harvard University in Cambridge, Massachusetts）的生物物理學(xué)家莊小威的實(shí)驗(yàn)室里做博士后研究，他現(xiàn)在就正在開(kāi)發(fā)這項(xiàng)技術(shù)。Fu 的策略是將超高分辨率的顯微鏡與莊小威之前開(kāi)發(fā)的一個(gè)單細(xì)胞內(nèi) RNA 可視技術(shù)——多重抗誤差矯正熒光原位雜交技術(shù)（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization, MERFISH）結(jié)合起來(lái)。Fu 表示，他近兩年已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但目前的問(wèn)題是數(shù)據(jù)噪聲太大，所以還需要進(jìn)一步優(yōu)化，使檢測(cè)的效率更高。

其它方面的工作還包括開(kāi)發(fā)新的 RNA 直接測(cè)序技術(shù)，以替代傳統(tǒng)的 RNA 測(cè)序方法。比如英國(guó)牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies in the United Kingdom）的科研人員就曾經(jīng)報(bào)道他們已經(jīng)成功地將 DNA 納米孔測(cè)序技術(shù)拓展成 RNA 納米孔測(cè)序技術(shù)。美國(guó)加利福尼亞州門(mén)羅公園的太平洋生物科技公司（Pacific Biosciences in Menlo Park, California）也成功地利用自己的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（single-molecule real-time，SMRT）直接對(duì) RNA 進(jìn)行了測(cè)序。據(jù)該公司的首席科學(xué)官 Jonas Korlach 介紹，其實(shí)這個(gè) RNA 測(cè)序技術(shù)的想法是和他們的 SMRT 測(cè)序技術(shù)同時(shí)誕生的。所謂 SMRT 測(cè)序技術(shù)，就是使用 DNA 聚合酶來(lái)擴(kuò)增 DNA 分子，在熒光標(biāo)記的核酸摻入新合成的 DNA 鏈時(shí)，同時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，完成測(cè)序工作。為了讓這項(xiàng)技術(shù)也能應(yīng)用于 RNA 測(cè)序工作，Korlach 和 Mason 等人將 DNA 聚合酶替換成了源自 HIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶。隨后還是利用 DNA 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，由于當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶通過(guò) RNA 鏈中發(fā)生了化學(xué)修飾的核酸位點(diǎn)時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄速度會(huì)明顯放慢，因此會(huì)產(chǎn)生一個(gè)很明顯的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)信號(hào)，借助這個(gè)信號(hào)就能夠很方便地知道，哪個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了化學(xué)修飾。

由于 RNA 與 DNA 存于差別，所以科研人員們碰上了很多以前在 DNA 測(cè)序時(shí)沒(méi)遇到過(guò)的困難。比如 RNA 分子自身非常容易發(fā)生折疊，形成各種環(huán)狀結(jié)構(gòu)（loop）和結(jié)狀結(jié)構(gòu)（knot）。所以英國(guó)牛津納米孔公司的方法就是讓 RNA 與一個(gè) cDNA 結(jié)合在一起，以消除 RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而可以通過(guò)納米孔通道。再比如，RNA 非常容易降解，所以在待測(cè) RNA 鏈非常長(zhǎng)的時(shí)候，也會(huì)帶來(lái)不小的麻煩。