眾所周知，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（PTM）對(duì)于增加蛋白質(zhì)組的功能多樣性，以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)亞基的水解或者整個(gè)蛋白質(zhì)的水解至關(guān)重要，因此探索蛋白質(zhì)翻譯后修飾在細(xì)胞生物學(xué)以及疾病預(yù)防和治療方面意義重大。大自然神奇之手讓酶和底物相互作用相互識(shí)別，并毫無偏差的對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定點(diǎn)修飾，從而控制著功能開關(guān)的開啟與關(guān)閉。人類之手能不能模仿進(jìn)化了數(shù)億年的生物化學(xué)修飾呢？近期，牛津大學(xué)Benjamin G. Davis小組在JACS上刊文用純化學(xué)手段證明了這一策略的可行性。（Selective Metal-Site-Guided Arylation of Proteins. J. Am. Chem. Soc., 2016,138, 8678-8681, DOI: 10.1021/jacs.6b04043）

傳統(tǒng)上對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾方法主要依賴于蛋白質(zhì)上某一特定殘基的化學(xué)選擇性，比如賴氨酸的氨基或者半胱氨酸的巰基都具有一定的親核性從而與某些親電試劑加成。這種修飾方法簡(jiǎn)單粗暴所以會(huì)導(dǎo)致多位點(diǎn)修飾的副產(chǎn)物，如何對(duì)某一特定位點(diǎn)殘基選擇性修飾就是一個(gè)問題。一個(gè)常用的解決方法是利用酶或者化學(xué)方法將某些非天然氨基酸（UAA）導(dǎo)入到蛋白質(zhì)特定位置上，這些非天然氨基酸帶有具有“正交試驗(yàn)”活性的基團(tuán)從而大大提高了化學(xué)選擇性。雖然有報(bào)道利用非天然氨基酸側(cè)鏈與金屬的螯合來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的修飾，但利用蛋白質(zhì)上天然存在的氨基酸殘基作為導(dǎo)向基團(tuán)進(jìn)行特定位點(diǎn)修飾卻鮮有報(bào)道。

Davis小組的設(shè)計(jì)思路基于金屬離子導(dǎo)向的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾，就像人的兩只手，左手（金屬離子）抓住蛋白質(zhì)上特定具有螯合配體性質(zhì)的位點(diǎn)（靶向性），右手（待修飾小分子化合物）與配體附近的氨基酸殘基反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)修飾（反應(yīng)活性）。自然界中不乏用金屬離子作為輔因子的酶（如紅素氧還蛋白、過氧化物歧化酶等），作者選擇用金屬離子依賴性A類糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）中的甘露糖基甘油酸合酶（MGS）作為模型系統(tǒng)。GT-A類酶有一DxD序列作為金屬螯合位點(diǎn)，具體到MGS的位點(diǎn)為D100A101D102，作者假設(shè)這三個(gè)位點(diǎn)可以被用作金屬-芳基化合物的結(jié)合位點(diǎn)，繼而將芳基轉(zhuǎn)移到鄰近的氨基酸殘基（如233位半胱氨酸殘基Cys233）上。

說干就干，首先，作者用活性較高的碘苯作為待修飾小分子，并選用鈀催化劑（水相反應(yīng)活性較好）作為金屬螯合劑，*終確定Pd(OAc)2（并用DM-ADHP作為配體）效果（65 °C）。值得一說的是，大牛Buchwald去年也在Nature上報(bào)道過用鈀催化劑對(duì)蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基進(jìn)行芳基修飾（點(diǎn)擊這里閱讀）。LC-MS證明只有單取代修飾產(chǎn)物生成，用內(nèi)消化酶水解蛋白質(zhì)并用LC-MS/MS分析確定修飾位點(diǎn)位于233位半胱氨酸殘基（Cys233）。并沒有影響其他位點(diǎn)的半胱氨酸殘基（如Cys34、Cys209、Cys305），特別是暴露出來的位阻較小的Cys305并沒有被修飾。

接下來作者從各個(gè)方面證明了螯合位點(diǎn)和反應(yīng)位點(diǎn)的缺一不可。首先，作者對(duì)其中的某些半胱氨酸突變成丙氨酸殘基（C34A、C209A、C233A），結(jié)果證明只有當(dāng)233位Cys殘基突變成Ala時(shí)（C233A），沒有修飾產(chǎn)物生成，說明反應(yīng)位點(diǎn)只在Cys233。另一方面，丙氨酸掃描突變分析技術(shù)（Ala-scanning mutational analysis）顯示D100、D102以及T139氨基酸殘基對(duì)于金屬離子螯合影響（雖然不是全部），證明了導(dǎo)向氨基酸殘基部位對(duì)于定點(diǎn)修飾的重要性。

得到這些證據(jù)后，作者擴(kuò)大了待修飾小分子底物范圍，結(jié)果顯示對(duì)各種芳香環(huán)的兼容性都很好，如帶有click把手的化合物12、13；帶有生物素把手的化合物14，這對(duì)于后期的熒光檢測(cè)或者親和色譜分離都非常具有優(yōu)勢(shì)。

*后，作者用此方法在細(xì)胞裂解液釣出了另一條大魚——chaperonin GroEL（用帶有生物素的芳基化合物14），此酶參與蛋白質(zhì)生物合成的*后幾步，并已知此酶的天冬氨酸殘基部分參與Mg離子的結(jié)合而發(fā)揮作用。

小小僧點(diǎn)評(píng)：

1）成果很漂亮，證明了蛋白質(zhì)的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)可以作為化學(xué)修飾的導(dǎo)向基團(tuán)，具有很高的特異性，工作做得非常完善。2）是否只能用于某些特定蛋白質(zhì)（具有金屬離子螯合位點(diǎn)）的檢測(cè)、分離？3）反應(yīng)條件是否需要進(jìn)一步優(yōu)化？畢竟不是所有蛋白質(zhì)在65°C都能穩(wěn)定。