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技術(shù)文章
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）試劑盒資料
產(chǎn)品說明書（中文版）
試劑盒用途
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過乳酸脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)測定細胞或組織樣品中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的含量，即采用比色法測定其氧化后峰值的變化，進行濃度測算的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞或組織裂解懸液樣品（動物、人體、植物、昆蟲等）還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）是糖酵解通路中通過轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）而產(chǎn)生乙醇所必須的輔助因子，是細胞生理學(xué)中能量代謝、脂肪酸代謝和糖代謝的重要因子。通常乳酸脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)被用于測定NADH（340nm 波長）的濃度，其反應(yīng)方式為：
丙酮酸+ NADH← 乳酸 脫氫酶→乳酸+ NADH+
（高吸收峰）（低吸收峰）
產(chǎn)品內(nèi)容
緩沖液（Reagent A）毫升
反應(yīng)液（Reagent B）毫升
酶促液（Reagent C）微升
陰性液（Reagent D）毫升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
保存 反應(yīng)液（Reagent B）和 酶促液（Reagent C）在－20℃冰箱里；其余的保存在 4℃
冰箱里； 反應(yīng)液（Reagent B）避免光照；有效保證 6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于反應(yīng)液配制的容器比色皿：用于比色的容器分光光度儀：用于比色分析
酶標儀：用于微量樣品比色分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 反應(yīng)液（Reagent B）和 酶促液（Reagent C）
置入冰槽里融化； 反應(yīng)液（Reagent B）避免光照。然后進行下列操作。
一、 測定準備
1． 準備好待測 NADH 的樣品（例如細胞或組織裂解懸液樣品等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 25℃）：波長 340nm，設(shè)置 0 分鐘和 5 分鐘各測讀 1 次，并置零
| 二、 背景對照測定 |
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| 1． 移取 | 微升 緩沖液（Reagent | A）到新的比色皿 |
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| 2． 加入 | 微升 反應(yīng)液（Reagent | B） |
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| 3． 加入 | 微升 酶促液（Reagent | C） |
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| 4． 置于 25℃溫度下孵育 5 分鐘，避免光照 |
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| 5． 放進分光光度儀，置零 |
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| 6． 取出比色皿 |
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| 7． 加入 | 微升 陰性液（Reagent | D） |
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| 8． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)） |
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| 9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0 分鐘讀數(shù)－5 分鐘讀數(shù)） |
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| 三、 樣品測定 |
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| 1． 移取 | 微升 緩沖液（Reagent | A）到新的比色皿 |
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| 2． 加入 | 微升 反應(yīng)液（Reagent | B） |
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| 3． 加入 | 微升 酶促液（Reagent | C） |
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| 4． 置于 25℃溫度下孵育 5 分鐘，避免光照 |
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| 5． 放進分光光度儀，置零 |
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| 6． 取出比色皿 |
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| 7． 加入 100 微升（20 微克總蛋白）待測樣品（注意：樣品須清澈） |
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| 8． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)） |
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| 9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0 分鐘讀數(shù)－5 分鐘讀數(shù)） |
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| 10．（選擇步驟）重復(fù)實驗步驟 1 至 9，測讀新的樣品 |
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| 四、計算樣品濃度 |
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| （樣品讀數(shù) − 背景對照讀數(shù) ）× 樣品稀釋倍數(shù) |
| = | 物質(zhì)的量濃度 • μmol ⋅ ml−1 | = 樣品濃度 • μmol ⋅ mg | −1 | |
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| 0.1ml（樣品容量 ） × 6.22（毫摩爾吸光系數(shù) ） |
| 質(zhì)量濃度濃度 • mg ⋅ ml-1 |
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| 五、酶標板測定 |
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| 1． 在 96 孔酶標板上做好相應(yīng)標記：背景對照和待測樣品 |
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| 2． 分別移取 | 微升 緩沖液（Reagent | A）到相應(yīng)孔中 |
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| 3． 分別加入 | 微升 反應(yīng)液（Reagent | B） |
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| 4． 分別加入 | 微升 酶促液（Reagent | C） |
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5． 輕輕搖動酶標板，混勻
| 6． 置于 25℃溫度下孵育 5 分鐘，避免光照 |
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| 7． 分別加入 | 微升 陰性液（Reagent | D）和待測樣品（10 微克總蛋白） |
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| 8． 輕輕搖動酶標板，混勻 |
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| 9． 即刻放進酶標儀檢測：0 分鐘讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù) |
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| 10．濃度計算： |
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| （樣品讀數(shù) − 背景對照讀數(shù) ）× 樣品稀釋倍數(shù) | = | 物質(zhì)的量濃度 • μmol ⋅ ml−1 | = 樣品濃度 • μmol ⋅ mg | −1 | |
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| 0.025ml （樣品容量 ） × 6.22（毫摩爾吸光系數(shù) ）× 0.5 | 質(zhì)量濃度濃度 • mg ⋅ ml-1 |
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注意事項
1． 本產(chǎn)品為 21 次（比色皿）和 80 次（酶標板）操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需 1 次
4． 樣品須澄清，至關(guān)重要
5． 孵育時，避免光照
6． 加樣后即刻比色測定
7． 反應(yīng) 1 分鐘后比色測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定持續(xù) 5 分鐘（終點測定）
8． 比色測定后，比色皿須清洗徹底
9． 建議待測樣本的 OD340 為 0.2 至 0.8 為理想狀態(tài)
10．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
11．本公司提供系列細胞生化檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
原創(chuàng)作者：齊一生物科技（上海）有限公司
