旦準(zhǔn)備好，樣品蛋白質(zhì)通過 PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離，這可以在天然或變性條件下進(jìn)行。蛋白質(zhì)印跡指南的這部分詳細(xì)介紹了您在分離蛋白質(zhì)時(shí)可能需要考慮的事項(xiàng)。

SDS-PAGE 通常用于蛋白質(zhì)印跡，其中蛋白質(zhì)被變性和還原以獲得它們的初結(jié)構(gòu)。用 SDS 分子（十二烷基硫酸鈉）包被會產(chǎn)生與其分子量成正比的相對負(fù)電荷，從而允許僅按大小分離蛋白質(zhì)。Native PAGE 省略了 SDS 的使用，用于觀察不同的蛋白質(zhì)特征。它很少通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)步處理，更常見的是用考馬斯或銀染色。天然 PAGE 中的蛋白質(zhì)遷移率取決于電荷和流體動(dòng)力學(xué)大小，這由多肽折疊決定。以特定方式折疊的小蛋白質(zhì)可能比更大、更緊密折疊的多肽具有更大的流體動(dòng)力學(xué)尺寸。此外，可以保留多聚體結(jié)構(gòu)。

SDS-PAGE 是通過將蛋白質(zhì)引入丙烯酰胺凝膠基質(zhì)并施加電流將帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)拉過凝膠來進(jìn)行的。丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的密度阻礙了蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。較小的蛋白質(zhì)比較大的蛋白質(zhì)更快地通過凝膠，在電泳期間通過凝膠更遠(yuǎn)，并且看起來更接近凝膠的末端。相反，較大的蛋白質(zhì)抵抗遷移并保持更接近凝膠的開始。包含已知大小蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)標(biāo)記可以與樣品同時(shí)加載，以校準(zhǔn)分離蛋白質(zhì)的大小。

也可以使用其他類型的凝膠，這些凝膠通過大小以外的特性分離蛋白質(zhì)。例如，等電聚焦凝膠 (IEF) 凝膠根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) (pI) 分離蛋白質(zhì)，該等電點(diǎn)對應(yīng)于蛋白質(zhì)不帶凈電荷的 pH 值。除了凝膠本身之外，這些其他類型的凝膠通常還需要門的緩沖液和分子量標(biāo)記。

將蛋白質(zhì)樣品裝入樣品孔中，在夾在兩個(gè)緩沖液室之間的聚丙烯酰胺凝膠中形成細(xì)齒。垂直電泳儀如圖 1 所示。

個(gè)室連接到陰J，樣品加載孔暴露在此處，第二個(gè)室連接到凝膠末端的陽J。施加電壓，蛋白質(zhì)通過凝膠向陽J移動(dòng)。 

蛋白質(zhì)大小和凝膠基質(zhì)的密度決定了分離的速度；較小的蛋白質(zhì)比較大的蛋白質(zhì)遷移得更快。

準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)鑒定和定量需要高質(zhì)量的分離。必須使用適當(dāng)?shù)哪z特性和上樣濃度來確保充分分離。

Jackson公司：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠用作分離基質(zhì)。

堅(jiān)固、親水、熱穩(wěn)定、透明和相對化學(xué)惰性，這確保了在過程中不會破裂或熔化，并且蛋白質(zhì)很容易觀察到。

化學(xué)反應(yīng)不會干擾蛋白質(zhì)遷移，并且由凝膠密度控制的孔徑可以變化。

不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠

PAGE 中使用的大多數(shù)凝膠由兩個(gè)凝膠區(qū)域形成：由較低密度凝膠制成的濃縮凝膠和較高密度的分離凝膠。

較小的蛋白質(zhì)通過濃縮膠快速遷移，并阻礙了通過分離膠的遷移。

較大的蛋白質(zhì)通過濃縮膠緩慢遷移，可能不會滲透到分離膠中。

梯度凝膠

梯度凝膠用于允許在同測定中分離不同分子量范圍的蛋白質(zhì)，從而允許從同樣品中分離低分子量和高分子量蛋白質(zhì)。凝膠的選擇取決于所需的蛋白質(zhì)分離。

聚合和澆注凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是通過化學(xué)或光引發(fā)聚合丙烯酰胺單體和 N,N＇-亞甲基-雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的溶液制成的。聚合的化學(xué)引發(fā)使用過硫酸銨等化合物引發(fā)反應(yīng)，使用 N,N,N＇,N＇-四亞甲基二胺等化合物來穩(wěn)定鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。聚合的光引發(fā)使用核黃素，將其添加到溶液中并暴露在玻璃板之間的長波紫外線下，并用水飽和的丁醇覆蓋。這不包括抑制鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的分子氧。

凝膠的密度由丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的濃度決定。增加丙烯酰胺濃度會增加凝膠密度。有多種厚度的預(yù)制凝膠可供選擇，但手工澆注凝膠是博士學(xué)位。通過儀式。

高分子量蛋白質(zhì)

PAGE 可用于分離 5 至 200 kDa 的蛋白質(zhì)。對于大分子量蛋白質(zhì)（700–4,200 kDa），瓊脂糖凝膠比聚丙烯酰胺凝膠提供更好的分離。（表）

Jackson公司：緩沖液 pH

pH 影響蛋白質(zhì)遷移；因此，運(yùn)行緩沖液的 pH 值必須高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，以保持其凈負(fù)電荷，因此它們向陽J移動(dòng)。連續(xù)密度凝膠在兩個(gè)腔室中使用相同的緩沖液，而不連續(xù)凝膠則需要不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)。通常使用 Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠 pH 值約為 7.0，分離膠 pH 值介于 8.0 和 9.0 之間。需要時(shí)可以使用其他門的緩沖系統(tǒng)。例如，在分離J低分子量的蛋白質(zhì)/肽時(shí)，Tricine 緩沖液是理想的選擇。

在高 pH 分離凝膠中，半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵。為了解決這個(gè)問題，可以將還原劑添加到緩沖液中。如果正在執(zhí)行天然 PAGE，則可以添加緩沖范圍為 7.4 至 8.8 的兩性離子氨基酸，例如曲辛堿，作為替代溶液。

Jackson公司：用分子量標(biāo)記確定蛋白質(zhì)大小

蛋白質(zhì)大小根據(jù)分子量標(biāo)記進(jìn)行校準(zhǔn)。這些由系列具有已知分子量的蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)與樣品同時(shí)在平行通道中運(yùn)行。

未知多肽的分子量可以通過計(jì)算標(biāo)記物的相對遷移距離 (Rf) 與感興趣的蛋白質(zhì)行進(jìn)的距離相比較來估計(jì)。分子量標(biāo)記也是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的有用指標(biāo)。

預(yù)染分子量標(biāo)記可用于監(jiān)測電泳過程中蛋白質(zhì)遷移的進(jìn)程。在添加免疫試劑之，還可以通過用染料（例如麗春紅 S）暫時(shí)染色膜來觀察標(biāo)記物。如果凝膠不進(jìn)行免疫印跡，可以在電泳后用考馬斯亮藍(lán)或銀染色來觀察未標(biāo)記的標(biāo)記物。（表二）

陰性組織對照

陰性對照使用已知不表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞或組織樣本。當(dāng)這些與未知樣品起運(yùn)行時(shí)，不應(yīng)檢測到與目標(biāo)蛋白大小相同的對照帶。運(yùn)行陰性對照以識別抗的非特異性檢測。陰性對照信號表明抗與樣品中的蛋白質(zhì)相互作用，而不是感興趣的蛋白質(zhì)，例如培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白質(zhì)。

另種有用的陰性對照是免疫印跡，其中抗被排除在外，通常稱為無抗對照。此類對照中的陽性信號表明二抗與樣品中的蛋白質(zhì)直接結(jié)合。例如，如果樣品中含有小鼠 IgG，則使用小鼠組織樣品的蛋白質(zhì)印跡可能會產(chǎn)生陽性信號，這將被抗小鼠 HRP 偶聯(lián)的二抗檢測到。

加載控件

上樣對照用于評估 PAGE 的致性，它們產(chǎn)生的信號可用于在定量過程中使孔之間的測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。

上樣控制的種形式是測量來自每個(gè)樣品中摻入的蛋白質(zhì)的信號。這可用于確認(rèn)在電印跡過程中從凝膠均勻轉(zhuǎn)移到膜上，并可用于在分析過程中使孔之間的信號標(biāo)準(zhǔn)化。在組成樣品的組織或細(xì)胞中表達(dá)的管家蛋白，例如肌動(dòng)蛋白，可用作上樣對照。特別是，他們確認(rèn)孔中裝載了相同數(shù)量的樣品，并且可以識別樣品處理差異。

Jackson公司注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務(wù)域覆蓋各大學(xué)科研所和醫(yī)院里的動(dòng)物研究以及生物醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)的科學(xué)家。艾美捷科技是Jackson公司的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。

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