化學發(fā)光蛋白質印跡法是種高靈敏度的蛋白質檢測方法。寬動態(tài)范圍允許在很寬的蛋白質濃度范圍內(nèi)進行分析物檢測。報告酶的線性響應與增強的化學發(fā)光 (ECL) 底物相結合，使檢測方法適用于定量分析。

當與適當?shù)幕瘜W發(fā)光底物結合時，報告酶偶聯(lián)二抗可用于化學發(fā)光檢測。如下圖中所述，報告酶催化化學發(fā)光底物轉化為發(fā)光產(chǎn)物。然后使用電荷耦合器件 (CCD) 數(shù)碼相機或 X 射線膠片捕獲光，從而識別感興趣的蛋白質。

這期的主題是Jackson ImmunoResearch公司為大家講解：化學發(fā)光免疫印跡。

圖 ：化學發(fā)光檢測。A.酶聯(lián)二抗與目的蛋白的抗結合。B. 將化學發(fā)光底物添加到抗體-抗原復合物中。C.報告酶將底物催化成發(fā)光產(chǎn)物，信號可以通過（CCD）數(shù)字成像儀或X射線膠片檢測。

：信號穩(wěn)定性

分析物的信號輸出是瞬態(tài)的，僅在酶-底物反應期間產(chǎn)生。信號會在底物耗盡時衰減，盡管酶會保持活性。在某些情況下，底物可持續(xù)長達 24 小時，但在分析物濃度高的情況下，信號輸出可能只有幾分鐘。如果需要，可以通過添加新底物來刷新分析物信號。

為了優(yōu)化信號到背景捕獲并避免信號飽和，可能需要多次曝光。如果使用 X 射線膠片，在抗原低或抗親和力差的情況下，顯影可能需要 24 小時曝光，并且在優(yōu)化過程中可能會使用許多膠片。數(shù)字成像通過 5 到 5 分鐘之間的信號捕獲簡化了曝光優(yōu)化，并且可以以少的資源或時間浪費生成圖像。

二、定量

報告酶對 ECL 底物催化的線性特性使其成為定量蛋白質印跡的理想選擇。Image J 和 Image Quant 是許多圖像分析軟件之，可用于評估分析物帶相對于對照帶的密度（光密度），從而得出分析物的相對數(shù)量。

必須設置印跡，以使檢測不在飽和J限，由實驗試劑的滴定確定。必須包括加載控制，并且必須補償背景信號。應該注意的是，如果需要非常準確的定量，使用標準曲線的 ELISA 可能更適用。

三、靈敏度

化學發(fā)光檢測非常靈敏，皮克量的檢測經(jīng)常被報道。通過優(yōu)化，可以檢測到飛克量的分析物�？梢允褂镁哂胁煌`敏度的化學發(fā)光底物，并且底物的選擇可能取決于分析物的豐度。

多路復用——在同個印跡上檢測多種分析物

當?shù)鞍踪|具有多個標簽時，在同印跡上檢測多個蛋白質可能有助于測試蛋白質表達，例如用于純化的 His6 和用于檢測的更敏感的 FLAG。如果由于截斷、蛋白水解或初錯誤導致個初沒有檢測到樣品中的標簽，研究人員可以探測第二個標簽以確認表達。

化學發(fā)光蛋白質印跡不能進行多重檢測，但可以使用剝離緩沖液剝離它們并用另對抗體重新探測。剝離緩沖液通常很苛刻，可能會改變第二次初獲得的信號，因此不建議將剝離的印跡用于定量分析。熒光蛋白質印跡為檢測多種抗原提供了種更加可靠的方法——了解更多關于熒光蛋白質印跡的信息。

四、Jackson公司：辣根過氧化物酶偶聯(lián)物

報告酶辣根過氧化物酶 (HRP) 是種流行的二抗偶聯(lián)物。與過氧化物緩沖液結合，HRP 將化學發(fā)光底物魯米諾氧化為其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物 3-氨基鄰苯二甲酸酯。該產(chǎn)品在衰減到其基態(tài)時會發(fā)出 425 nm 的光，該信號可以被 X 射線膠片或 CCD 相機捕獲。

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五、Jackson公司：堿性磷酸酶偶聯(lián)物

堿性磷酸酶可用于化學發(fā)光檢測，底物為二鈉-氯-5-(4-甲氧基螺{1,2-二氧雜環(huán)丁烷-3,2＇-(5＇-氯)三環(huán)癸烷}-4-基)-1-苯基磷酸鹽），它被 AP 去磷酸化，產(chǎn)生亞穩(wěn)態(tài)的苯酚二氧雜環(huán)丁烷陰離子，該陰離子在 466 nm 處發(fā)光（Schaap 等人 1989）。發(fā)射的光穩(wěn)定長達 24 小時，允許多次曝光 X 射線膠片。

辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶偶聯(lián)物是適用于所有免疫技術的敏感試劑。

文獻參考：

A E Kalyuzhny A (2016) Immunohistochemistry – Essential Elements ａnd Beyond.  Springer International Publishing Switzerland.

A P Schaap, H Akhavan ａnd L J Romano (1863) Chemiluminescent substrates for alkaline phosphatase: application to ultrasensitive enzyme-linked immunoassays ａnd DNA probes. Clinical Chemistry Sep 1989, 35 (9) 1863-1864;

Jackson公司注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務域覆蓋各大學科研所和醫(yī)院里的動物研究以及生物醫(yī)學研究機構的科學家。艾美捷科技是Jackson公司的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質的產(chǎn)品與服務。

來源：https://www.amyjet.com/brand/jackson-china-distributor.shtml