用于編輯基因的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的開發(fā)正在徹底改變基因工程。1 , 2與疾病過程（例如 HIV 感染）相關(guān)的生物途徑特別令人感興趣。3 HIV 通過感染和破壞免疫系統(tǒng)的細胞，特別是對哺乳動物適應(yīng)性免疫反應(yīng)很重要的 T 細胞，對免疫系統(tǒng)造成嚴重損害。不同的研究實驗室已經(jīng)開發(fā)了 CRISPR/Cas 基因編輯模型，以試圖減少 HIV 感染。

CRISPR/Cas 初被發(fā)現(xiàn)是原核適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。CRISPR 代表成簇的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列，它是包含短重復(fù)堿基 DNA 序列的原核 DNA 片段。重復(fù)由短間隔外源 DNA 隔開，該外源 DNA 源自原核生物（細菌和古生菌）先暴露于質(zhì)粒或噬菌體病毒。

CRISPR 與 CRISPR 相關(guān) (CAS) 基因協(xié)同發(fā)揮作用，使原核適應(yīng)性免疫系統(tǒng)能夠識別、響應(yīng)和消除外源 DNA。CRISPR/Cas 基因編輯被稱為分子剪刀，因為它基本上將外源 DNA（質(zhì)粒和噬菌體）從原核基因組中剪掉。已將原核生物中的 CRISPR/Cas 基因編輯與真核生物中的 RNA 干擾或基因沉默進行了類比。

正在利用原核 CRISPR/Cas 機制來開發(fā)豐富的編輯工具，例如用于哺乳動物細胞的 CRISPR/Cas9。CRISPR/Cas9 有兩個主要組成部分：Cas9 和 RNA 向?qū)�，后者通過互補核苷酸結(jié)合將 Cas9 靶向特定的 DNA 片段。Cas9 是種核酸內(nèi)切酶，通過與向?qū)?nbsp;RNA 結(jié)合以序列特異性方式切割雙鏈 DNA。引導(dǎo) RNA 包含與目標 DNA 配對的核苷酸。

RNA 向?qū)Ы?jīng)過基因工程改造，可與選擇的基因靶標配對，并與 Cas9 起遞送至細胞。當 RNA 將 Cas9 引導(dǎo)至目標基因組序列時，它允許 Cas9 在基因組中選定的目標點切割兩條 DNA 鏈。然后可以在 Cas9 切割位點修改、插入或移除 DNA。

研究人員設(shè)計了 RNA 指導(dǎo)，以指導(dǎo) Cas9 切割含有必需基因或長末端重復(fù)序列的 HIV 病毒 DNA 的不同區(qū)域。3 CRISPR/Cas9 基因編輯可顯著抑制各種研究細胞模型中的 HIV 病毒產(chǎn)生和感染，包括人類多能干細胞、原代 CD4+ T 細胞和 CD4+ T 細胞系。從理論上講，消除受感染細胞中病毒表達所必需的 HIV 病毒 DNA 或基因應(yīng)該能夠滅活或擺脫 HIV 感染。

不幸的是，研究人員還在些實驗中顯示細胞產(chǎn)生了 CRISPR/Cas9 抗性突變。當 Cas9 被定向切割時，這些突變聚集在病毒位點。Cas9 無法切割目標位點，因此 CRISPR/CAS9 攻擊無效。3 HIV 與其他病毒樣，已知具有發(fā)展對其他攻擊機制（例如人類免疫系統(tǒng)和抗病毒藥物）的抵抗力的發(fā)達能力。

在對抗 HIV-1 感染的另種方法中，CRISPR/Cas9 已被用于消除 5 型趨化因子受體 (CCR5) 的表達。4CCR5 是種輔助受體，某些 HIV 類型需要它才能進入 T 細胞并引起 HIV 感染。研究人員用靶向 CCR5 的 CRISPR/CAS9 載體破壞了 CD34 陽性造血干細胞和祖細胞中的 CCR5 基因。研究人員表明，CCR-5 突變克隆保留了分化成多個造血譜系的能力，并且很少引入脫靶突變。這很重要，因為在基因編輯技術(shù)的關(guān)注中，安全性很高。因此，必須證明經(jīng)過編輯的細胞仍然可以發(fā)揮作用，并且避免了意外的、可能有害的突變。CRISPR/CAS 系統(tǒng)的成功和對局限性的認識都在推動優(yōu)化策略。

重要的是，突變 CCR5 的策略已在使用鋅指核酸酶 (ZFN) 的初始臨床醫(yī)學(xué)研究試驗中成功測試。ZFN 與 CRISP/Cas 樣，也是有途的基因編輯分子剪刀工具，用于減少細胞中的 HIV 表達。ZFN 是通過將 DNA 切割核酸酶結(jié)構(gòu)域與鋅指 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合而產(chǎn)生的。與 CRISPR/Cas 技術(shù)中使用的 RNA 向?qū)�，鋅指結(jié)構(gòu)域可以設(shè)計為靶向特定的 DNA。包含 Fok1 限制性內(nèi)切酶的核酸酶結(jié)構(gòu)域是分子剪刀組件，可催化切割目標 DNA。SB-728-T，也稱為 CCR5-ZFN，是種在研基因治療 ZFN 藥物（clinicaltrials.gov：NCT01543152、NCT01252641 和 NCT01044654）。

CCR5-ZFN 的機制是基于 CCR5 的基因工程修飾，使 CCR5 無功能，細胞更能抵抗 HIV 感染。CCR5-ZFN 試劑是自給定個體獲得的自體 T 細胞，例如 CD4+ T 細胞，通過鋅指核酸酶在 CCR5 基因上進行基因修飾并重新引入宿主生物體。修飾后的 CCR5 基因座可能消除 HIV 進入并感染 T 細胞的個場所（CCR5 受體）。4 CCR5-ZFN/SB-728-T 正在用于研究以確定 CCR5 轉(zhuǎn)基因細胞是否對 HIV 感染具有抗性。研究人員還渴望確定 CCR5-ZFN/SB-728-T 是否可以將自身復(fù)制到額外的抗性細胞中，并通過阻止 HIV 進入細胞來恢復(fù)受感染宿主的免疫細胞功能。

艾美捷Mybiosource 為基因編輯研究用途提供以下研究工具：

人趨化因子受體 5 型 (CCR5)，ELISA 試劑盒（#MBS2020083）

CRISPR/Cas9，單克隆抗體（#MBS375383）

S. Pyogenes CRISPR 相關(guān)蛋白 9 核酸酶，重組蛋白（#MBS140642）

HIV（人類免疫缺陷病毒）ELISA 試劑盒（#MBS766122）

HIV-2 gp39，單克隆抗體（#MBS430025）

HIV Gp41/gg36，重組蛋白（#MBS319756）

HIV-1 p24，單克隆抗體（#MBS8241470）

HIV-1 Tat 相互作用蛋白 2 單克隆抗體 ELISA 試劑盒（#MBS732587）

艾美捷Mybiosource 提供相關(guān)參考文獻：

1. Mojica FJ M, Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea ａnd bacteria. 2016. FEBS J, 283: 3162-3169. doi:10.1111/febs.

2. Tschaharganeh DF, Lowe SW, Garipp RJ, Livshits G. Using CRISPR/Cas to study gene function ａnd model disease in vivo. 2016. FEBS J, 283: 3194-3203. doi:10.1111/febs.13750

3. Liang C, Wainberg MA, Das, AT, Berkhout B. 2016. CRISPR/Cas9: a double-edged sword when used to combat HIV infection. Retrovirology, 13:37. doi:10.1186/s12977-016-0270-0

4. Savic N, Schwank G. 2016 Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Translational Res 168:15-21Khan doi: dx.doi.org/10.1016/j.trsl.2015.09.008

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