ELISpot原理：將細(xì)胞置于包被有特異性抗體的96孔板中培養(yǎng)，在有刺激的條件下，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或免疫球蛋白會被包被抗體捕獲。移除細(xì)胞后，被捕獲的細(xì)胞因子可進(jìn)步使用生物素標(biāo)記的二抗來標(biāo)識，其后再與酶標(biāo)記的親和素作用，并加入底物使其呈色，有反應(yīng)作用的細(xì)胞會留下直徑大小不等的染色斑點(diǎn)。

常見疑難問題解答：

1.推薦哪種ELISpot板子？

建議使用PVDF膜的96孔ELISpot板子，有效結(jié)合大量捕獲抗體，提是膜用乙醇預(yù)處理（即活化）。

2.板的顏色是否重要，我應(yīng)選擇白色板子還是透明板子？

白色和透明ELISpot板具有相同類型的PVDF膜。這兩種顏色在讀板儀中略有不同，但并不重要。（如果有沒有添加液體的漏掉的孔，透明的板子很容易看見。）

3.包被為什么要用乙醇對ELISpot板進(jìn)行預(yù)處理？

ELISpot板子的膜具有多孔疏水結(jié)構(gòu)。為了使大量捕獲抗體能夠結(jié)合，應(yīng)該用乙醇處理膜以使其親水。這是獲得高質(zhì)量斑點(diǎn)所必需的致密抗體包被層。ELISpot板子的逐步預(yù)包被和EtOH處理的protocol。

4.冷凍細(xì)胞可以用于ELISpot嗎？

冷凍保存的細(xì)胞非常適合ELISpot。然而，其結(jié)果取決于細(xì)胞的質(zhì)量，必須建立冷凍/解凍的程序以產(chǎn)生具有高活力的細(xì)胞。標(biāo)準(zhǔn)冷凍程序應(yīng)包括使用DMSO和胎牛血清或類似物，并逐步冷凍程序。

5.在ELISpot中每孔使用多少個(gè)細(xì)胞？

必須將每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為細(xì)胞類型和分泌細(xì)胞的預(yù)期頻率。如果頻率非常低，例如10,000個(gè)細(xì)胞中的1個(gè)，則需要更多數(shù)量的細(xì)胞，通常約250,000個(gè)細(xì)胞/孔。當(dāng)分泌細(xì)胞的頻率高時(shí)，例如10個(gè)細(xì)胞中的1個(gè)，約5,000個(gè)細(xì)胞/孔就足夠了。細(xì)胞數(shù)量在測定中并不總是顯示線性，因?yàn)樾枰?xì)胞-細(xì)胞的zui佳接觸，例如抗原呈遞細(xì)胞的充分刺激。當(dāng)分析抗原特異性T細(xì)胞時(shí)，PBMC不應(yīng)低于每孔200,000個(gè)細(xì)胞。

通常不建議使用超過500,000個(gè)細(xì)胞/孔，因?yàn)檫@可能產(chǎn)生多個(gè)細(xì)胞層，反過來由于細(xì)胞和ELISpot膜之間的距離增加而導(dǎo)致斑點(diǎn)質(zhì)量降低。

6.可以在ELISpot中使用人血清嗎？

由于以下原因，不建議在ELISpot中使用人血清。當(dāng)分析人類樣品時(shí)，感興趣的分析物（例如IFN-γ或IgG）實(shí)際上可能存在于血清中。由于分析物將與捕獲和檢測抗體結(jié)合，因此會導(dǎo)致膜變暗。人血清可能含有嗜異性抗體，其可與來自許多物種的Ig交叉反應(yīng)。這種反應(yīng)可能會導(dǎo)致雙抗夾心免疫檢測中抗體交聯(lián)的問題。在ELISpot中，它將導(dǎo)致膜的普遍變暗。

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分析物（指標(biāo)）與種屬的對應(yīng)表格（如下指標(biāo)均有對應(yīng)產(chǎn)品）：

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