同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)，借助顯微擴(kuò)張技術(shù)，病理學(xué)家極大的提高了對(duì)微小病變腎病（MCD）診斷的準(zhǔn)確率（從 65% 增加到了 90%），以及經(jīng)過深度學(xué)習(xí)后的 AI 對(duì)于早期乳腺癌的診斷的 AUC 值（從 0.71 提高到了 0.93）（AUC 越接近 1 診斷越完美，越接近 0.5 診斷越隨機(jī)）。這一發(fā)現(xiàn)發(fā)表在近日的《自然生物技術(shù)》雜志上（1）。

Boyden 教授對(duì)顯微擴(kuò)張技術(shù)的介紹

這一技術(shù)有多牛呢？舉個(gè)例子，2014 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的三位得主的主要貢獻(xiàn)就是開發(fā)了超分辨熒光顯微鏡，成功將光學(xué)顯微鏡的分辨率帶入納米級(jí)。而相比于超分辨率熒光顯微鏡，Boyden 教授的顯微擴(kuò)增技術(shù)操作更加簡(jiǎn)單，并且更適用于臨床病理診斷。

早在 2015 年的時(shí)候，Boyden 教授就在《科學(xué)》雜志上發(fā)表了顯微擴(kuò)張技術(shù)的具體方法（2）。利用這一技術(shù)，他們成功在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到了小鼠神經(jīng)突觸的細(xì)微結(jié)構(gòu)，并且小鼠腦組織樣本在放大后的結(jié)構(gòu)誤差僅 2% 左右。只不過當(dāng)時(shí)的顯微擴(kuò)張技術(shù)只適合科學(xué)研究，并不適合臨床病理使用。隨后，Boyden 教授便對(duì)其進(jìn)行了一系列的優(yōu)化。

2016 年的時(shí)候，Boyden 教授先后開發(fā)出了對(duì)樣本組織蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)方法以及適合 RNA 熒光原位雜交的顯微擴(kuò)張技術(shù)（3，4）。而今年 4 月份 Boyden 教授更是開發(fā)了重復(fù)顯微擴(kuò)張技術(shù)，允許對(duì)樣本進(jìn)行再次擴(kuò)張（5）。

此次，Boyden 教授主要開發(fā)了一系列的臨床病理標(biāo)本處理方法以及 DNA 熒光原位雜交的方法，并首次證明了用顯微擴(kuò)張技術(shù)進(jìn)行臨床病理檢測(cè)的可行性，成功的擴(kuò)張了乳腺，前列腺，肺，結(jié)腸，肝，腎，卵巢，胰腺等多種器官的正常和癌癥組織切片。

其實(shí) Boyden 教授的方法很簡(jiǎn)單，但是也很容易被忽視。一般來說，要想提高顯微鏡的分辨率，正常人時(shí)間想到的肯定是在顯微鏡或者光源上做文章。而 Boyden 教授卻想到了一種截然不同的思路，他想通過對(duì)所觀察的樣本進(jìn)行均勻的物理擴(kuò)張來提高分辨率。

也就是說，在使用顯微鏡之前，先將樣本在空間上放大 100 倍。這樣不僅可以通過樣本自身在空間上的的擴(kuò)張來提高分辨率。同時(shí)，當(dāng)樣本擴(kuò)張之后，樣本中大分子物質(zhì)之間的間隙會(huì)被拉開，光的衍射作用就會(huì)減弱（光的衍射作用是限制光學(xué)顯微鏡分辨率*主要的原因），從而進(jìn)一步提高了顯微鏡的分辨率。

加水后樣本隨著高分子聚合物擴(kuò)張

這一技術(shù)聽起來也許很高大上，其實(shí)操作非常簡(jiǎn)單。首先，由于臨床病理組織切片都是經(jīng)過處理的，例如福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE），蘇木精和伊紅染色（H＆E），或者直接冷凍保存。所以，步需要利用 Boyden 教授所設(shè)計(jì)的一系列處理步驟（expansionmicroscopy.org 上有顯微擴(kuò)張技術(shù)的所有操作方法），將各種臨床病理樣本轉(zhuǎn)化為*適宜擴(kuò)張的狀態(tài)。

第二步，研究人員將合成嬰兒尿不濕中高分子聚合物的單體物質(zhì)加入樣本中，隨后引發(fā)聚合反應(yīng)，在樣本中蛋白質(zhì)周圍形成大量的高分子聚合物，同時(shí)將樣本中的蛋白質(zhì)錨定在高分子聚合物上。第三步，加入適量含蛋白酶 K 的溶液切斷組織細(xì)胞以及蛋白質(zhì)之間連接，以便均勻擴(kuò)張。*后加水，在蛋白質(zhì)的推動(dòng)下，組織細(xì)胞會(huì)隨著高分子材料均勻擴(kuò)張，同時(shí)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記以便觀察（DNA，RNA 熒光原位雜交技術(shù)也可以使用）。

樣本中蛋白質(zhì)隨著高分子材料擴(kuò)張

隨后，為了驗(yàn)證顯微擴(kuò)張技術(shù)是否真的有助于臨床病理診斷。研究人員選擇了兩種臨床常見的并且具有挑戰(zhàn)性的疾病，微小病變腎病（MCD）和早期乳腺癌，來驗(yàn)證其效果。

首先是 MCD，長(zhǎng)期以來，MCD 以及局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥 （FSGS） 的診斷都需要借助電子顯微鏡（6）。因?yàn)椋��?MCD 患者體內(nèi)，本應(yīng)該呈手指裝包裹在微血管周圍的腎臟足細(xì)胞，失去了自己的形態(tài)特征，而每個(gè)足突的大小在 200 納米左右，超過了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率極限，只能在電子顯微鏡下觀看。而當(dāng)研究人員按顯微擴(kuò)張技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)制作了正常人體腎臟組織切片后，他們成功的在光學(xué)顯微鏡下看到了足細(xì)胞的突起。同時(shí)，研究人員還對(duì)比了正常人體腎臟切片和 MCD 患者腎臟切片在顯微擴(kuò)張技術(shù)下和電子顯微鏡下的照片。結(jié)果顯示，顯微擴(kuò)張技術(shù)與電子顯微鏡所顯示的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是一致的。表明，在顯微擴(kuò)張技術(shù)下，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡也可以區(qū)分臨床病理組織樣本中納米級(jí)的區(qū)別。

此外，為了進(jìn)一步確定，顯微擴(kuò)張技術(shù)是否有助于病理學(xué)家進(jìn)行 MCD 以及 FSGS 診斷，研究人員還請(qǐng)來了四位病理學(xué)家以及三位非病理學(xué)家，在經(jīng)過培訓(xùn)后，對(duì)從 3 位正常人，2 位 MCD 患者，1 位 FSGS 患者體內(nèi)提取的 10 張沒有擴(kuò)張的組織免疫染色顯微鏡照片以及 10 張擴(kuò)張后的顯微鏡照片進(jìn)行診斷。

結(jié)果研究人員發(fā)現(xiàn)，對(duì)于未擴(kuò)張的照片，診斷的準(zhǔn)確率只有 65.7%。然而對(duì)于擴(kuò)張后的照片，診斷的準(zhǔn)確率竟然高達(dá) 90%。不僅如此，對(duì)于擴(kuò)張后的照片，大家的診斷更容易達(dá)成一致，而對(duì)于沒有擴(kuò)張的照片，則很容易引起分歧。

正常人體腎臟組織，未擴(kuò)張的樣本（左）分辨率顯著小于擴(kuò)張后的樣本（右）（同一顯微鏡觀察）

這些試驗(yàn)證明，顯微擴(kuò)張技術(shù)的確是一種簡(jiǎn)單，高效，準(zhǔn)確的方法，有助于疾病的診斷。正如 Boyden 教授所說，“現(xiàn)在，你診斷腎臟疾病可以無需昂貴的電子顯微鏡，你只需要一個(gè)光學(xué)顯微鏡加上一些化學(xué)試劑就夠了（7）。”

同樣地，乳腺癌的病理檢測(cè)不僅在臨床上有廣泛的需求，而且早期乳腺病變的診斷也是乳腺病理診斷中*具挑戰(zhàn)性的問題。有研究顯示，不同病理學(xué)家對(duì)于早期乳腺病變細(xì)胞核異型性診斷只有 50% 的一致性（8）。而早期乳腺病變的診斷往往對(duì)于指導(dǎo)患者的臨床治療非常重要。

研究人員認(rèn)為，病理學(xué)家對(duì)于早期乳腺病變的診斷之所以有很大的分歧，主要有兩個(gè)原因。首先，早期乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)很大程度依賴病理學(xué)家的主觀定性判斷。其次傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率是有限的，因此能提供的信息也是有限的。

所以，為了更好的進(jìn)行乳腺癌的診斷，研究人員開發(fā)了新的計(jì)算機(jī)病理模型用于早期乳腺良性惡性病變的區(qū)分。在經(jīng)過深度學(xué)習(xí)之后，研究人員使用這一模型來診斷早期乳腺癌。結(jié)果，研究人員發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行擴(kuò)張后的樣本中，計(jì)算機(jī)診斷的 AUC 值達(dá)到了 0.93，而未擴(kuò)張的樣本機(jī)器識(shí)別的 AUC 值只有 0.71（AUC 越接近 1 診斷越完美，越接近 0.5 診斷越隨機(jī)）。

總的來說，顯微擴(kuò)張技術(shù)不僅操作簡(jiǎn)單，而且還大大增加了臨床診斷的準(zhǔn)確性。準(zhǔn)確的診斷不僅讓患者更加安心，也使醫(yī)生能對(duì)病人做出更優(yōu)的治療方案。所以，顯微擴(kuò)張技術(shù)無疑具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。當(dāng)然，這一技術(shù)的大規(guī)模推廣還需要更大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。