規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（ CRISPRs ）配合與它相關(guān)的Cas蛋白賦予細(xì)菌或古生菌防御外源入侵的核酸，如噬菌體和質(zhì)粒 DNA[1]。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 Crispr/cas9 系統(tǒng)有三種類型，研究得*為透徹的是第二種類型[2]。在細(xì)菌防御反應(yīng)中，外源性DNA會(huì)被切割成很多小段，插入到CRISPR位點(diǎn)旁，然后被轉(zhuǎn)錄成Cr-RNA前體，繼續(xù)通過(guò)剪切變成成熟的 Cr-RNA 。相應(yīng)的反義鏈上會(huì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工，形成一個(gè)互補(bǔ)的 traCr-RNA ，跟Cas9核酸酶形成核蛋白復(fù)合體繼續(xù)識(shí)別和切割入侵的外源 DNA[2]。2012 年，Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna 用二型 Crispr/cas9 技術(shù)對(duì)釀膿鏈球菌基因組進(jìn)行編輯[3]。Cr-RNA 和 traCr-RNA 形成一個(gè)向?qū)�性�?sgRNA，通過(guò) Watson-Crick 互補(bǔ)配對(duì)原則定位到基因組特定位點(diǎn)，招募Cas9核酸酶過(guò)來(lái)切割 DNA，造成 DNA 雙鏈斷裂反應(yīng)（ DSB ）[3, 4]。Crispr/Cas9復(fù)合體通過(guò)兩種不同的機(jī)制對(duì)基因組進(jìn)行編輯。種方式是在缺少同源性DNA模板時(shí)，DSB 損傷修復(fù)主要是通過(guò)非同源末端連接（ NHEJ ），這是一種容忍差錯(cuò)的修復(fù)，會(huì)引起小的插入和缺失。第二種方式是在同源性 DNA 模板存在情況下，通過(guò)同源重組的方法進(jìn)行精確修復(fù)，也可以對(duì)特定的核苷酸序列進(jìn)行替換（如圖1所示）[5, 6]。

 

在 Crispr/cas9 之前，主要是用鋅指核酸酶和 TALEN 技術(shù)進(jìn)行 DNA 編輯。但是，涉及這種特異性識(shí)別DNA序列的蛋白基序非常耗時(shí)，這嚴(yán)重影響了技術(shù)的發(fā)展[7, 8]。Crispr/cas9技術(shù)具有鋅指核酸酶和TALEN技術(shù)無(wú)法比擬的可操作性，廣泛應(yīng)用于各種物種的DNA編輯，包括人和靈長(zhǎng)動(dòng)物[9-12]。這些研究表明 Crispr/Cas9 有望應(yīng)用于基因治療，可以改變引起疾病的基因的核酸序列。我們對(duì)*近應(yīng)用 Crispr/cas9 技術(shù)用于基因治療研究做一歸納。首先介紹一下，體內(nèi)條件下，Crispr/cas9 直接針對(duì)受精卵和成體動(dòng)物（如圖 2A 所示）。再綜述一下，通過(guò)體外培養(yǎng)細(xì)胞，用 Crispr/Cas9 體外敲除基因，這這些修飾過(guò)的細(xì)胞回輸入病人體內(nèi)，成功控制病人疾病的案例（如圖 2B 所示）。

 

 

 

1.Crispr/cas9對(duì)受精卵基因組編輯

 

共同注射 Cas9 的信使 RNA 或者蛋白，sgRNA 和 HDR 模板到受精卵或早期胚胎中可以改變所有細(xì)胞的基因組，包括生殖細(xì)胞。因此，這種方法造成的基因組改造可以遺傳到子代個(gè)體中，為消除家族性的遺傳疾病提供可能。上海生化細(xì)胞所的李勁松研究員首次報(bào)道用 Crispr/cas9 技術(shù)修復(fù)小鼠胚胎中引起疾病的突變基因。他們矯正了小鼠白內(nèi)障顯性突變基因 Crygc。他們將 Cas9的信使 RNA 和靶向 Crygc 基因的 sgRNA 同時(shí)注射到受精卵中，修復(fù)時(shí)以同源染色體上正常的基因做模板，進(jìn)行同源重組修復(fù)，*后矯正了的小鼠的白內(nèi)障[13]。另一項(xiàng)研究用 Crispr/Cas9 在小鼠胚胎中矯正肌萎縮蛋白基因，這種疾病是X染色體連鎖的遺傳性疾病[14]。在這項(xiàng)研究中，科研人員們同時(shí)注射Cas9 信使 RNA，sgRNA 和單鏈寡核苷酸片段一起到受精卵中進(jìn)行HDR修復(fù)。盡管作者們只獲得了部分細(xì)胞得到矯正的嵌合體，是由于 DNA 編輯發(fā)生后受精卵分化的之后，通過(guò)自然選擇后依然得到了表型完全矯正的小鼠。在*近的一項(xiàng)研究中，研究人員用 Crispr/cas9 技術(shù)在人胚胎細(xì)胞中中進(jìn)行了基因組編輯[15]，引發(fā)了一些生物倫理方面的爭(zhēng)論[16, 17]。研究報(bào)道說(shuō)在人胚胎的三原核合子中修改血紅素β基因，這個(gè)基因突變會(huì)造成地中海貧血癥。研究人員也發(fā)現(xiàn)了 Crispr/cas9 技術(shù)存在著脫靶風(fēng)險(xiǎn)，帶來(lái)很多不知道的 DNA 編輯，現(xiàn)在的技術(shù)用于臨床還存在風(fēng)險(xiǎn)�，F(xiàn)有的產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)，比如體外受精后遺傳篩選可以篩選掉存在先生性疾病的胚胎。生殖細(xì)胞基因組編輯主要也為那些需要優(yōu)化孩子一些性狀基因，如智商，相貌等等提供了可能。處于更多的安全和倫理問(wèn)題，并不建議將 Crispr/cas9 技術(shù)用于人合子基因組編輯合法化。

 

 

 

2.Crispr/cas9對(duì)體細(xì)胞的體內(nèi)編輯

 

Yin 等人運(yùn)用 Crispr/cas9 技術(shù)成功地對(duì)出生后Ⅰ型酪氨酸血癥小鼠進(jìn)行矯正[18]。Ⅰ型酪氨酸血癥在遺傳學(xué)上是由于缺少 fumarylacetoacetate hydrolase  （ FAH ） 酶引起的，導(dǎo)致肝細(xì)胞代謝毒物的積累而造成細(xì)胞死亡。通過(guò)尾靜脈注射 Cas9 載體，特異性的 sgRNA 和 DNA 模板在小鼠肝臟細(xì)胞進(jìn)行同源重組修復(fù)。突變的 FAH 酶被矯正，肝細(xì)胞毒性減弱，小鼠的體重回升。酪氨酸血癥非常適合用 Crispr/cas9 系統(tǒng)進(jìn)行基因治療，起初只有大約 0.4% 的肝細(xì)胞被矯正，后來(lái)通過(guò)肝細(xì)胞增殖和突變的肝細(xì)胞的死亡，整個(gè)肝臟機(jī)會(huì)恢復(fù)正常。

 

另外一項(xiàng)體內(nèi)研究是關(guān)于敲除小鼠肝臟細(xì)胞中 proprotein convertase subtilisin /kexin type 9 （ PCSK9 ） [19]。PCSK9從肝細(xì)胞中分泌到血漿中，作為低密度脂蛋白受體激動(dòng)劑，它控制低密度脂蛋白的攝取與降解。天然出現(xiàn)的PCSK9 突變會(huì)減少血液中的膽固醇水平。為了模擬天然出現(xiàn)的情況，研究者用 Crispr/cas9 腺病毒載體在小鼠肝臟細(xì)胞中敲除 PCSK9。這導(dǎo)致 PCSK9 蛋白水平的降低和低密度脂蛋白受體的升高。更為重要的是，這種方法是通過(guò)NHEJ方法造成肝細(xì)胞PCSK9的突變，效率高達(dá)50%，這足夠用于臨床治療。

 

Lin等人的研究證明了 Crispr/cas9 介導(dǎo)的基因組編輯同樣可以用于乙肝治療。許多乙肝病人，HBV的長(zhǎng)期慢性感染導(dǎo)致肝硬化和肝癌[20]。盡管已經(jīng)對(duì)乙肝病人的抗病毒治療有很多方法，仍不能徹底消除乙肝病人肝臟中的病毒。這是由于乙肝病毒基因組的復(fù)制中間體是一種類似質(zhì)粒一樣的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，非常穩(wěn)定。在這項(xiàng)研究中，從小鼠的尾靜脈注射 HBV 表達(dá)載體來(lái)模擬乙肝病毒感染的情況，同時(shí)注射 Crispr/cas9 系統(tǒng)靶向 HBV 表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)HBV表達(dá)載體會(huì)被清除。在小鼠血液中乙肝病毒表面抗原濃度會(huì)減弱。由于這個(gè)小鼠模型還不是產(chǎn)生正常乙肝病毒感染情況下共價(jià)閉合環(huán)狀復(fù)制中間體，研究人員又在人的細(xì)胞系中感染鴨乙肝病毒，并用 Crispr/cas9 系統(tǒng)靶向病毒基因組，結(jié)果進(jìn)一步證明 Crispr/cas9 的編輯作用完全可以徹底清除乙肝病毒。毫無(wú)疑問(wèn)，任何殘留的病毒基因組都會(huì)使得病毒死灰復(fù)燃，重新感染。因此，發(fā)展高效的 Crispr/cas9 系統(tǒng)對(duì)臨床治療很多必要。

 

在前面介紹臨床前的驗(yàn)證研究都是在小鼠模型進(jìn)行了 Crispr/cas9 進(jìn)行基因治療。真正用于臨床治療還需要克服幾個(gè)問(wèn)題。個(gè)問(wèn)題是，提供 Crispr/cas9 系統(tǒng)的效率和安全性。在過(guò)去的20多年中，對(duì)傳統(tǒng)的外源表達(dá)載體用于基因治療研究很多[21, 22]。這些研究研發(fā)了很多病毒和非病毒基因治療載體，這對(duì)運(yùn)送 Crispr/cas9 系統(tǒng)很有幫助。腺相關(guān)病毒穿梭載體由于它本身的高效率，適用細(xì)胞類型廣泛，低細(xì)胞毒性和低免疫原性而更具潛力。*新的研究可以把 Cas9和 sgRNA 放到一個(gè)腺相關(guān)載體中，他們將 Staphylococcus aureus 的小分子量 Cas9 克隆進(jìn)去[23]。第二個(gè)問(wèn)題是 Crispr/cas9 用于體內(nèi)基因治療的話，相對(duì)于 NHEJ，HDR 低效率怎么解決？這限制了它應(yīng)用于消除基因功能和矯正后增加細(xì)胞生存優(yōu)勢(shì)的基因治療。解決這個(gè)問(wèn)題的辦法是用配對(duì)的Cas9切口酶造成 DNA 單鏈斷裂，相對(duì)于 NHEJ，這會(huì)增加 HDR 修復(fù)的比例[24, 25]。第三個(gè)問(wèn)題是 Crispr/cas9 用于疾病治療的的安全問(wèn)題是它的脫靶效應(yīng)[26, 27]。這些不需要的雙鏈斷裂會(huì)造成突變和染色體的重排。Crispr/cas9 脫靶問(wèn)題還存在爭(zhēng)議，*近發(fā)明的全基因組分析方法可以控制它的脫靶問(wèn)題[28-31]。這些分析方法表明 sgRNA 之間的脫靶概率相差很大，從零到 150 個(gè)位點(diǎn)。切割效率從 0.03% 到 87%。即使非常低的脫靶效應(yīng)對(duì)于體內(nèi)基因治療也是問(wèn)題，如果是涉及到了腫瘤相關(guān)基因。因此，提高 Crispr/cas9 系統(tǒng)特異性尤為重要。兩項(xiàng)*近的研究表明在 sgRNA 5’端加上兩個(gè) G [32]或者將 sgRNA 縮短到17個(gè)核苷酸[33]。用配對(duì)的 Cas9 切口酶造成DNA單鏈斷裂而不是引起雙鏈斷裂[34, 35]，或者使用 dCas9-FokⅠ融合蛋白都可以大大減少脫靶突變效應(yīng)[36, 37]。

 

3.Crispr/cas9對(duì)體細(xì)胞的離體編輯

 

活體外的基因編輯，需要先培養(yǎng)病人來(lái)源干細(xì)胞或者前體細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外的基因組編輯后再回輸入病人體內(nèi)。2007 年，山中伸彌發(fā)明了誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞變成多能干細(xì)胞[38]。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可以無(wú)限增殖并可以分化成任何類型的細(xì)胞，這對(duì)離體的基因治療提供了可能。另外，過(guò)去的幾年中，研究人員建立了體外培養(yǎng)成體干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法[39-41]。這種方法得到的干細(xì)胞并沒(méi)有去分化的步驟，也比誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞更為安全。

 

Crispr/cas9 離體的基因編輯的實(shí)驗(yàn)性研究起始于用它對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞進(jìn)行編輯，用來(lái)治療β珠蛋白生成障礙性貧血[42]。目前，治療β珠蛋白生成障礙性貧血的方法是回輸組織相容的健康捐獻(xiàn)者的造血干細(xì)胞。矯正病人來(lái)源的誘導(dǎo)性的多能干細(xì)胞為生產(chǎn)可移植的造血干細(xì)胞提供一個(gè)備選方案。研究人員從 β 珠蛋白生成障礙性貧血病人身上取下成纖維細(xì)胞，然后誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染靶向性的 Crispr/cas9 和 DNA 模板進(jìn)行 HDR 修復(fù)，同源重組修復(fù)通過(guò)抗性基因篩選，篩選后通過(guò)轉(zhuǎn)座酶切除，再將這樣的多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)成紅細(xì)胞的前體細(xì)胞，然后用于移植。Hans Clevers 主持的一項(xiàng)研究證明 Crispr/cas9 系統(tǒng)可用于原代的成體干細(xì)胞的基因組編輯。在體外培養(yǎng)的小腸類器官模型中，可以無(wú)限地?cái)U(kuò)增多能腸干細(xì)胞，然后用 Crispr/cas9 矯正囊腫性纖維化[43]。囊腫性纖維化是一種單基因性遺傳病，是由于 CFTR 基因突變后造成胃腸道，肺支氣管的粘液積累造成一定的癥狀，如呼吸困難，反復(fù)感染。 分離培養(yǎng)了囊腫性纖維化病人的腸隱窩，在體外三維培養(yǎng)成類器官，然后轉(zhuǎn)染進(jìn) 靶向 CFTR 基因座的 Crispr/cas9 和 DNA 模板進(jìn)行同源重組修復(fù)。 嘌呤霉素篩選后，通過(guò)測(cè)序和功能試驗(yàn)證明成功矯正 CFTR 基因。進(jìn)而又檢測(cè)了這個(gè)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)很少。

 

兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用 Crispr/cas9 技術(shù)矯正 DMD 病人來(lái)源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和永生化細(xì)胞系[44, 45]。DMD 是由于抗肌萎縮蛋白基因的突變，引起肌肉纖維結(jié)構(gòu)的改變。失去這個(gè)基因的功能會(huì)使得肌肉纖維結(jié)構(gòu)的改變，*終引起骨骼肌，呼吸和心肌的衰退。個(gè)實(shí)驗(yàn)室用 Crispr/cas9 聯(lián)合 DNA 模板通過(guò)同源重組的方法恢復(fù)抗肌萎縮蛋白全長(zhǎng)基因，原先的 DMD 病人的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞缺少第44位的外顯子。修復(fù)的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞通過(guò)篩選后可誘導(dǎo)分化成表達(dá)野生抗肌萎縮蛋白基因的骨骼肌細(xì)胞。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)室在 DMD 病人來(lái)源的成心肌細(xì)胞系中缺失單個(gè)或多個(gè)外顯子恢復(fù)抗肌萎縮蛋白的讀碼框。多重基因編輯可以建立一個(gè)缺失突變熱點(diǎn)的 45 到 55 位外顯子，幾乎 60% 的 DMD病人都時(shí)基因突變發(fā)生在該區(qū)域。這種缺失修復(fù)后，無(wú)論在體外還是在移植到小鼠體內(nèi)都能回復(fù)抗肌萎縮蛋白的表達(dá)。

 

*后，另外一項(xiàng)基于 Crispr/cas9 技術(shù)的離體基因編輯研究處理 HIV 感染[46]。HIV感染的周期是先整合到宿主的免疫細(xì)胞T細(xì)胞基因組中，然后作為模板進(jìn)行病毒復(fù)制。如果基因組轉(zhuǎn)錄沉默會(huì)導(dǎo)致潛伏感染。由于病毒潛伏在長(zhǎng)壽命的記憶性T細(xì)胞中，即使存在著抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物，感染會(huì)無(wú)限地持續(xù)。運(yùn)用基因組編輯技術(shù)，研究人員近來(lái)用了兩種方案對(duì)針對(duì) HIV 潛伏感染，病毒基因組被核酸酶靶向后消除整合在T細(xì)胞基因組中的HIV病毒 DNA 。基于這項(xiàng)研究，*近在原代艾滋病人的 CD4 陽(yáng)性T細(xì)胞中，用 Crispr/cas9 系統(tǒng)靶向高度保守的 HIV 病毒 TLR 區(qū)域后，發(fā)現(xiàn)病毒的產(chǎn)生和潛在感染源得到消除。研究人員又進(jìn)一步證明了，經(jīng)過(guò)靶向 TLR 的 Crispr/cas9 的 HIV 可感染細(xì)胞，而這樣的細(xì)胞是從誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化而來(lái)的，可以抵抗新的 HIV 感染。另一個(gè)方法是，通過(guò)基因組編輯去除賦予 HIV 病毒抵抗性的 CCR5 受體，它是HIV感染T細(xì)胞的輔助性受體。Mandal 等人用 Crispr/cas9 編輯技術(shù)敲除 CD341 陽(yáng)性造血干細(xì)胞上的 CCR5 [47]。他們用靶向性 CCR5 的 Crispr/cas9 載體轉(zhuǎn)染 CD341 陽(yáng)性造血干細(xì)胞，敲除效率大約為 30%。同時(shí)，他們也證明敲除 CCR5 的多能造血干細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)，仍保持分化成多個(gè)血液系統(tǒng)細(xì)胞的潛能，很少脫靶。更為重要的是，鋅指核酸酶靶向的 CCR5 已經(jīng)成功地在臨床上通過(guò)試驗(yàn)[48]。

 

4.展望

 

離體的基因治療的優(yōu)勢(shì)在于可以體外篩選和分析矯正的細(xì)胞。因此，只有被矯正而又沒(méi)有脫靶的細(xì)胞才會(huì)被選擇回輸進(jìn)病人體內(nèi)。由于有篩選檢測(cè)的過(guò)程，離體情況下的 Crispr/cas9 介導(dǎo)的基因組編輯的效率和精確性比起直接體內(nèi)操作要求顯得寬松一些。缺點(diǎn)在于，離體編輯需要通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞，在培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)造成基因組的改變。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在重編程和擴(kuò)增過(guò)程中容易積累突變和發(fā)生 CNV [49, 50]。盡管*近的研究表明體外三維培養(yǎng)的成體干細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性很高，但是體外細(xì)胞擴(kuò)增仍然存在安全問(wèn)題。離體基因治療的另外一個(gè)問(wèn)題是高效的移植正確的細(xì)胞�，F(xiàn)在已經(jīng)在臨床上有很成熟造血干細(xì)胞移植的技術(shù)，但是其它組織，如肝和肌肉細(xì)胞移植技術(shù)還在改進(jìn)中。毫無(wú)疑問(wèn)，盡管存在這么多問(wèn)題，這么多障礙， Crispr/cas9 技術(shù)仍然是臨床基因治療的巨大期望，未來(lái)會(huì)有翻天覆地的變化。

 

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