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技術(shù)文章
PITC為柱前衍生試劑的氨基酸分析
摘要：
采用異硫氰酸苯酯（PITC）為柱前衍生試劑進(jìn)行氨基酸衍生，二元流動(dòng)相程序洗脫方法分離17種常見(jiàn)氨基酸，分離效果好，無(wú)需柱后反應(yīng)裝置，反應(yīng)速度快，保留時(shí)間重現(xiàn)性好。
實(shí)驗(yàn)部分：
儀器與試劑：
Labtech LC600高效液相色譜儀；Labtech 氨基酸色譜柱（5um, 250×4.6mm）；17種氨基酸標(biāo)樣；乙腈（色譜純）；水（超純水）；醋酸鈉（分析純）；醋酸（分析純）；三乙胺；異硫氰酸苯酯。
色譜條件：
流動(dòng)相A：乙腈/B＝1/1（V：V），流動(dòng)相B：50mmolNaAC緩沖溶液（PH=6.5）流速：1ml/min，進(jìn)樣1uL（自動(dòng)進(jìn)樣方式），檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，柱溫為40℃。
梯度程序：
Time （min） | Mobile phase A （V/V） | Mobile phase B （V/V） |
0 | 10 | 90 |
5 | 10 | 90 |
20 | 30 | 70 |
45 | 60 | 40 |
50 | 95 | 5 |
55 | 95 | 5 |
55:10 | 10 | 90 |
75 | 10 | 90 |
柱前衍生步驟：
1. 17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱(chēng)取適量天門(mén)東氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、胱氨酸于容量瓶中，以0.1N鹽酸定容，得到2.5mmol/L混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液（其中胱氨酸1.25mmol/L）。
2. 1mol/L三乙胺乙腈溶液：取三乙胺139ul，加乙腈860ul。
3. 1mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液：取12ulPITC加乙腈988ul。
4. 對(duì)照品溶液的衍生：取氨基酸溶液800ul置離心管中，加1mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液400ul，1mol/L三乙胺乙腈溶液400ul，混勻，室溫放置1小時(shí)，加入正己烷1.6ml，放置10分鐘，取下層溶液進(jìn)樣。
結(jié)果與討論：
取衍生好的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品，連續(xù)測(cè)定10次，因次進(jìn)樣系統(tǒng)未完全平衡好，保留時(shí)間有漂移，*后一次進(jìn)樣由于室內(nèi)溫度較高，考慮到樣品放置時(shí)間長(zhǎng)可能會(huì)對(duì)峰面積有影響，故舍去與*后一次進(jìn)樣，統(tǒng)計(jì)8次進(jìn)樣結(jié)果和重疊色譜圖如下，
氨基酸重復(fù)性結(jié)果（n＝8）
Amino Acid
| Retention time | Area |
RSD% | RSD% | |
Asp | 0.31 | 6.97 |
Glu | 0.25 | 7.19 |
Ser | 0.15 | 7.08 |
Gly | 0.12 | 6.59 |
His | 0.11 | 6.50 |
Arg | 0.11 | 6.97 |
Thr | 0.11 | 6.26 |
Ala | 0.13 | 7.29 |
Pro | 0.11 | 6.70 |
Tyr | 0.11 | 6.81 |
Val | 0.15 | 6.69 |
Met | 0.15 | 6.75 |
Cys-Cys | 0.19 | 17.04 |
Lle | 0.19 | 6.73 |
Leu | 0.20 | 6.90 |
Phe | 0.17 | 6.62 |
Lys | 0.15 | 8.90 |
8次重復(fù)進(jìn)樣色譜圖
從數(shù)據(jù)可得知保留時(shí)間有較好的重現(xiàn)性，RSD0.31%，由于進(jìn)樣1ul，進(jìn)樣量較小，所以峰面積的RSD稍大，在實(shí)際測(cè)定工作當(dāng)中可以加大進(jìn)樣量和添加內(nèi)標(biāo)的方式改善。
原創(chuàng)作者：萊伯泰科有限公司
