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基于體外細(xì)胞培養(yǎng)和模型的化妝品抗衰老功效評(píng)價(jià)
點(diǎn)擊次數(shù)：239 發(fā)布時(shí)間：2021/1/5 10:09:30
本文要點(diǎn)：角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及相關(guān)模型與抗衰老功效評(píng)價(jià)
01
皮膚衰老的特征指標(biāo)
衰老細(xì)胞發(fā)生的變化：細(xì)胞形態(tài)變大，扁平;衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal) 活性增強(qiáng);p16上調(diào);lamin B1表達(dá)減少;HMGB1核移位至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外液;衰老相關(guān)分泌表型(SASP)的分泌，包括炎癥細(xì)胞因子和金屬蛋白酶......
SASP由促炎細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子和基質(zhì)重塑酶等一系列細(xì)胞因子組成，它們可以導(dǎo)致機(jī)體慢性低度炎癥和疾病，并可以反作用于衰老細(xì)胞及其鄰近細(xì)胞加速它們的衰老進(jìn)程，并可作為新的細(xì)胞衰老效應(yīng)機(jī)制。
圖1 年輕和衰老皮膚示意圖
(Biomarkers of Cellular Senescence ａnd Skin Aging,2018)
圖2 與皮膚衰老相關(guān)的生物指標(biāo)
(Biomarkers of Cellular Senescence ａnd Skin Aging,2018)
02
基于人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的抗衰老功效評(píng)估
人表皮中的主體細(xì)胞成分是角質(zhì)形成細(xì)胞，此類細(xì)胞經(jīng)過(guò)增殖和分化 ，*終形成包括基底層 、棘層 、粒層 及角質(zhì)層的表皮復(fù)層結(jié)構(gòu) 。人角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮中重要的細(xì)胞，也是紫外線敏感的靶細(xì)胞。近年來(lái)研究表明，人角質(zhì)形成細(xì)胞在光老化的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，在加重炎癥反應(yīng)方面也尤為突出。
圖3 炎癥因子含量隨著紫外照射劑量的增加而增加
紫外線可活化Rel家族中的核因子κB，導(dǎo)致細(xì)胞因子、黏附分子以及一氧化氮合成酶和環(huán)氧化酶等炎癥性酶類合成。促炎性細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素（IL）1β、IL⁃6、IL⁃8和腫瘤壞死因子TNF-α等。上述細(xì)胞因子又可通過(guò)促進(jìn)活化蛋白1和核因子κB途徑，放大皮膚對(duì)UV照射的反應(yīng)。
人皮膚永生化角質(zhì)細(xì)胞 HaCaT是非腫瘤來(lái)源的人正常皮膚角質(zhì)形成永生化細(xì)胞株，較易于培養(yǎng)及傳代。目前 HaCaT細(xì)胞株已被廣泛應(yīng)用于化妝品的抗衰老及透皮性的研究中。
在 Zöller 等的一項(xiàng)體外研究中，比較了培養(yǎng)基中添加溫泉水（理膚泉、雅漾）和飲用天然礦泉水（heppinger、adelholzener）對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞生理參數(shù)的影響。結(jié)果表明，溫泉水被 UV 刺激后產(chǎn)生活性氧，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄測(cè)定，發(fā)現(xiàn)可反轉(zhuǎn)IL⁃6的誘導(dǎo)；天然礦泉水也能對(duì)上述炎性因子產(chǎn)生影響，但程度較輕。
03
成纖維細(xì)胞的抗衰老功效評(píng)估
人皮膚成纖維細(xì)胞(Human skin fibroblasts, HSF)是人體皮膚真皮中的主體細(xì)胞，具有合成和分泌膠原纖維、彈性纖維及其他機(jī)質(zhì)成分的功能，這些成分和成纖維細(xì)胞共同維持真皮層的彈性。
圖4 成纖維細(xì)胞在自然老化和光老化中的區(qū)別
研究人員證實(shí)，自然老化皮膚的膠原降低是由于成纖維細(xì)胞合成膠原減少，分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1，MMP-2)增加，而光老化皮膚的膠原減少主要是成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶增加，膠原合成下降不明顯。由此可見(jiàn)成纖維細(xì)胞的膠原代謝在自然老化和光老化之間有一定差別。
1 體外增殖能力檢測(cè)
成纖維細(xì)胞除了分泌膠原纖維、彈性纖維維持皮膚彈性之外，還有趨化性和粘附性 ，對(duì)維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用，HSF的數(shù)量減少是引起皺紋產(chǎn)生的重要原因。
真皮中成纖維細(xì)胞的數(shù)量及活力均會(huì)影響膠原蛋白的分泌、膠原蛋白纖維的數(shù)量以及膠原蛋白纖維束構(gòu)造。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是其增殖*有效的刺激因子，可以作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，評(píng)價(jià)化妝品是否有效刺激成纖維細(xì)胞增殖。
圖5 基于成纖維細(xì)胞的樣品增殖效果測(cè)試
2 膠原含量檢測(cè)
膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中*活躍的成分，是創(chuàng)面愈合和瘢痕形成的關(guān)鍵因素，在皮膚功能修復(fù)中起重要作用。正常成人皮膚中HSF分泌的膠原主要以Ⅰ和Ⅲ 型為主。其中Ⅰ型膠原是構(gòu)成正常成人皮膚的主體， 而正常胎兒皮膚主要由Ⅲ型膠原組成。
膠原含量的測(cè)定有多種方法，通過(guò)ELISA 法和western Blot和免疫熒光等方法可分別精確定量體外培養(yǎng)的HSF分泌及細(xì)胞本身膠原含量的變化。
圖6 基于成纖維細(xì)胞的膠原蛋白定量檢測(cè)（免疫熒光法；來(lái)自博溪生物）
3 抗氧化功效檢測(cè)
正常人體細(xì)胞每天生化代謝產(chǎn)生大量的ROS。細(xì)胞中過(guò)氧化物酶發(fā)揮了清除ROS的功能，起抗氧化作用。其中超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）在自由基生成的起始階段發(fā)揮預(yù)防性作用，而谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH- Px）發(fā)揮抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)直接檢測(cè) HSF內(nèi)ROS水平的改變、通過(guò)比色法檢測(cè)SOD，CAT 和GSH-Px等酶活性的變化，均能靈敏反映出化妝品抗氧化功效。
4 其他衰老相關(guān)生物指標(biāo)檢測(cè)
衰老細(xì)胞通常體積變大，溶酶體衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）酶活性增高。采用免疫組化法觀察β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞的顏色變化以及用比色法定量β-半乳糖苷酶活性，可以評(píng)估HSF衰老程度的變化。
丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化重要產(chǎn)物，在衰老過(guò)程中顯著累積，與皮膚老年斑（褐脂質(zhì)）含量呈正相關(guān)。目前ＭＤA被認(rèn)為是一種重要的衰老生物標(biāo)記物，通過(guò)ELISA法檢測(cè)MDA含量變化是比較靈敏的HSF老化評(píng)價(jià)方法。
5 案例展示
Wang等發(fā)現(xiàn)紫外線輻照后成纖維細(xì)胞中 SA-β-gal 活性增強(qiáng)，作為衰老的生物標(biāo)志物，表明 UVB 照射誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài);同時(shí)觀察到染料木素能有效地抑制 SA-β-gal 的表達(dá)，且呈劑量依賴性（SA-β-gal 染色陽(yáng)性細(xì)胞為藍(lán)色）。
Wang Y N , Wu W , Chen H C , et al. Genistein protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal fibroblast by p66Shc down-regulation[J]. Journal of Dermatological ence, 2010, 58(1):19-27.
圖7 UVB 照射誘導(dǎo) HDFs 中 SA-β-gal 表達(dá)及染料木黃酮的保護(hù)作用
接下來(lái)，用不同濃度的染料木黃酮處理細(xì)胞24小時(shí)，ELISA檢測(cè) HDFs 細(xì)胞內(nèi) SOD 和 MDA 水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使在沒(méi)有 UVB 照射的情況下，染料木黃酮處理仍能誘導(dǎo) HDFs 中 SOD 活性并抑制細(xì)胞內(nèi) MDA 水平。
UVB 輻照導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) SOD 活性顯著降低，同時(shí)細(xì)胞內(nèi) MDA 水平升高，說(shuō)明 HDFs 對(duì) UVB 的氧化應(yīng)激反應(yīng)增加。而加入不同濃度的染料木黃酮后，引起細(xì)胞內(nèi) SOD 活性的增加，在高劑量時(shí) MDA 水平顯著降低。
圖8 不同濃度的染料木黃酮對(duì)成纖維細(xì)胞內(nèi)SOD和MDA水平的影響
04
三維皮膚模型抗衰老功效評(píng)價(jià)
隨著三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，三維人造皮膚模型可以在體外培養(yǎng)中模擬人體皮膚構(gòu)造以及皮膚不同細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的各種反應(yīng)，使它更有效地應(yīng)用于化妝品工業(yè)，對(duì)于快速篩選新型功效性原料具有實(shí)際意義。
在三維皮膚模型上評(píng)價(jià)抗皺劑等的功效性與單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，更接近于生物體的真實(shí)狀態(tài)，可以用于毒性分析和功效測(cè)試，是保證化妝品安全功效的重要手段。
實(shí)驗(yàn)時(shí)將活性物質(zhì)配制成膏霜等劑型，涂于重建皮膚模型上，通過(guò)測(cè)試相關(guān)指標(biāo)，如清除自由基能力、 抗氧化能力和膠原蛋白含量，可以考察化妝品對(duì)細(xì)胞增殖分化及抗氧化能力的影響。
圖9 3D皮膚模型的給藥方式（來(lái)自博溪生物）
基于三維皮膚模型的抗衰老功效評(píng)價(jià)體系，可以分為抗表皮衰老和抗真皮衰老。兩者可以通過(guò)構(gòu)建不同的模型來(lái)實(shí)現(xiàn)更好的生物學(xué)指標(biāo)響應(yīng)。
比如表皮模型是由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建形成，如下圖所示。構(gòu)建完成后，通過(guò)低劑量的UV照射連續(xù)照射進(jìn)行干預(yù)，隨后對(duì)組織形態(tài)、屏障相關(guān)指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。
圖10 體外重組表皮模型的工藝流程及評(píng)測(cè)指標(biāo)
此外還可以通過(guò)構(gòu)建全層皮膚模型進(jìn)行真皮抗衰的評(píng)價(jià)。它的特點(diǎn)在于有真表皮結(jié)構(gòu)，可以在體外進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)含量變化的檢測(cè)，從而進(jìn)行抗衰老原料特別是化妝品成品的篩選。詳情可點(diǎn)擊鏈接《它為什么可以評(píng)估化妝品抗光損傷的效果？》
05
離體皮膚
離體皮膚的特點(diǎn)在于它天然而復(fù)雜組織構(gòu)成：包括了天然表皮層和真皮層，真皮層中的纖維包括膠原纖維（95%）、彈力纖維和網(wǎng)狀纖維等，這樣的天然構(gòu)成，使一體化地觀測(cè)受試樣品對(duì)皮膚的綜合或者特定影響成為可能。
但是，離體皮膚難獲取、難培養(yǎng)也使很多研究者望而卻步。
目前博溪生物已經(jīng)攻克了離體皮膚培養(yǎng)的問(wèn)題，并應(yīng)用離體皮膚來(lái)進(jìn)行化妝品的功效評(píng)價(jià)。首先要解決的核心問(wèn)題是“長(zhǎng)程培養(yǎng)”的問(wèn)題。目標(biāo)是要讓離體皮膚單元保持正常的生理活性，以滿足各類檢測(cè)、樣品長(zhǎng)時(shí)間暴露的需求，同時(shí)關(guān)注增殖與分化指標(biāo)的平衡問(wèn)題。
1 離體皮膚的培養(yǎng)
1）首先從臨床取得捐獻(xiàn)的離體皮膚組織，用皮膚取樣器分割成一定大小的單元，用于后續(xù)研究；
2）對(duì)離體皮膚單元進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，這是*為關(guān)鍵的步驟；在博溪生物的體系中，采用了自主開(kāi)發(fā)的培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行，這也得益于一直專注于皮膚模型開(kāi)發(fā)的培養(yǎng)基技術(shù)的積累。
3）培養(yǎng)完成之后，收集離體皮膚單元，進(jìn)行具體指標(biāo)的檢測(cè)。
圖11 離體皮膚的培養(yǎng)流程
2 基于Exvivo的抗衰老評(píng)價(jià)體系
在光輻照的誘導(dǎo)下，皮膚細(xì)胞經(jīng)歷高水平、長(zhǎng)期的氧化應(yīng)激損傷；氧化應(yīng)激和慢性炎癥又進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的水平降低和細(xì)胞功能的老化；因此，我們?cè)诳顾プo(hù)膚品設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)中，可以從拮抗氧化應(yīng)激、增加ECM合成、降低ECM降解、以及修復(fù)衰老細(xì)胞等角度入手。
圖11 基于離體皮膚(ex vivo skin)的抗衰評(píng)價(jià)指標(biāo)
3 案例展示：樣品對(duì)離體皮膚(ex vivo skin)彈性纖維的影響
圖12 免疫組化法檢測(cè)樣品對(duì)離體皮膚彈性纖維的影響（博溪生物）
結(jié)論：從IHC染色結(jié)果看，對(duì)照組真皮層內(nèi)可見(jiàn)長(zhǎng)束狀彈性纖維，排列均勻、有序，UVR 照射處理后彈性纖維減少，排列稀疏、 多呈斷層式分布。陽(yáng)性物質(zhì)使用后，彈性纖維密度明顯提升。
上述方法，匯總和梳理了基于體外細(xì)胞培養(yǎng)和模型建立的抗衰老功效評(píng)價(jià)方法，旨在針對(duì)不同的功效和評(píng)價(jià)需求,體外培養(yǎng)特定細(xì)胞或建立細(xì)胞損傷模型,使用目標(biāo)成分刺激，觀察細(xì)胞形態(tài)和毒性增殖等指標(biāo),通過(guò)分析特定基因通路、相關(guān)蛋白表達(dá)等分子生物學(xué)手段對(duì)原料或者成品進(jìn)行功效評(píng)價(jià)。
由于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具有經(jīng)濟(jì)成本較低、實(shí)驗(yàn)周期較短、實(shí)驗(yàn)對(duì)象相對(duì)穩(wěn)定且操作方法成熟等特點(diǎn),應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)方法建立體外培養(yǎng)皮膚細(xì)胞模型成為化妝品原料篩選和活性物質(zhì)功效評(píng)價(jià)的主流方法。
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參考文獻(xiàn)
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