ELISA試劑盒預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

ELISA試劑盒預(yù)實(shí)驗(yàn)是為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性,驗(yàn)證試劑盒的靈敏度和特異性,同時(shí)為正式實(shí)驗(yàn)提供參考。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),可以了解實(shí)驗(yàn)條件、操作流程和注意事項(xiàng),為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)和幫助。

二、實(shí)驗(yàn)原理

ELISA試劑盒是一種基于酶聯(lián)吸附法的檢測(cè)方法,通過(guò)將特異性抗體或抗原與酶結(jié)合,形成酶標(biāo)抗體或抗原。當(dāng)待測(cè)樣本與酶標(biāo)抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合時(shí),酶會(huì)催化底物生成有色產(chǎn)物,通過(guò)顏色變化來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣本中的抗原或抗體。預(yù)實(shí)驗(yàn)則是通過(guò)調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件,如溫度、時(shí)間、濃度等,來(lái)驗(yàn)證試劑盒的 反應(yīng)條件。

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三、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 準(zhǔn)備試劑和樣本

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備所需的試劑和樣本。確保試劑的質(zhì)量和有效性,同時(shí)對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砗拖♂尅?/span>

2. 設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的目的,設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)條件,如溫度、時(shí)間、濃度等。一般而言,可以通過(guò)設(shè)置不同的溫度、時(shí)間和濃度梯度來(lái)尋找 反應(yīng)條件。

3. 實(shí)驗(yàn)操作

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下,分別進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),以減少誤差和提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

4. 結(jié)果觀察和記錄

觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,記錄每個(gè)條件下的吸光度值或顏色變化情況。通過(guò)比較不同條件下的結(jié)果,可以確定 反應(yīng)條件。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

1. 確定 反應(yīng)條件

通過(guò)對(duì)不同條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,可以確定 反應(yīng)條件。這些條件包括溫度、時(shí)間、濃度等。在 反應(yīng)條件下,酶標(biāo)抗體或抗原與待測(cè)樣本中的抗原或抗體能夠充分結(jié)合,生成的顏色變化 ,從而得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

2. 驗(yàn)證試劑盒的靈敏度和特異性

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),可以驗(yàn)證試劑盒的靈敏度和特異性。靈敏度是指試劑盒能夠檢測(cè)到的小抗原或抗體濃度;特異性則是指試劑盒只與特定的抗原或抗體結(jié)合,不與其他物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,可以通過(guò)比較不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或已知樣本的檢測(cè)結(jié)果,來(lái)評(píng)估試劑盒的靈敏度和特異性。

五、注意事項(xiàng)

1. 嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程,避免污染和交叉反應(yīng)。
2. 在使用試劑盒時(shí),要注意試劑的有效期和質(zhì)量,避免使用過(guò)期或質(zhì)量不佳的試劑。
3. 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,要注意觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,及時(shí)記錄和整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
4. 在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí),要結(jié)合試劑盒說(shuō)明書(shū)和相關(guān)文獻(xiàn)資料,進(jìn)行科學(xué)合理的解釋和評(píng)估。

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效果測(cè)定
測(cè)定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。
⑴ 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴(kuò)散或電泳法,使抗原與抗體形成沉淀線(xiàn),經(jīng)PBS漂洗1天,再以蒸餾水浸泡1小時(shí),將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色,如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng),再用生理鹽水浸泡,顏色仍然不褪,表示結(jié)合物既有酶的活性,也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后,瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個(gè)測(cè)定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA方法進(jìn)行方陣滴定,此法不僅可以測(cè)定標(biāo)記效果,還可以確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。
⑵ 結(jié)合物的定量測(cè)定 一般是對(duì)結(jié)合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測(cè)定。常用紫外分光光度計(jì)于403nm和280nm進(jìn)行測(cè)定,然后按下列公式計(jì)算:
酶量(mg/ml)=OD403×0.42
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.4)×0.94×0.62
對(duì)于過(guò)碘酸鈉氧化法制備的標(biāo)記抗體量,按下列公式計(jì)算:
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.34)×0.62
已知酶量和IgG量后,即可計(jì)算出標(biāo)記抗體的摩爾(mol)比值。
HRP/IgG摩爾比值=HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4
結(jié)合物中酶總量=HRP(mg/ml)×結(jié)合物溶液量
結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標(biāo)記時(shí)加入的酶量×
用于ELISA的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時(shí)效果一般,為500(g/ml時(shí)效果較好,達(dá) 1000(g/ml時(shí)效果 。mol.比值由于結(jié)合物中含的IgG并不完全可靠,所以不能作為主要參數(shù)。一般認(rèn)為mol.比值為0.7時(shí)效果一般,1.0時(shí)效果較好,1.5-2.0時(shí) 。酶結(jié)合率為 7%時(shí)效果一般,為9%-10%較好,達(dá)30%以上時(shí) 。
ELISA方法的基本類(lèi)型、用途及操作程序
根據(jù)ELISA所用的固相載體而區(qū)分為三大類(lèi)型:一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA,即我們通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一類(lèi)是用硝酸纖維膜為載體的ELISA,稱(chēng)為斑點(diǎn)ELISA(Dot-ELISA);再一類(lèi)是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA,稱(chēng)為布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中,又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。
間接ELISA
本法主要用于檢測(cè)抗體。以鴨(DVH)抗體的ELISA為例,間接ELISA的操作程序如下。
⑴ 材料
① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液;
② DVH包被抗原、酶標(biāo)抗抗體、陰性及陽(yáng)性DVH參考血清;待檢鴨血清;
③ ELISA檢測(cè)儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
⑵ 方法步驟
① 加抗原包被 → 4℃過(guò)夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時(shí),洗滌三次、拋干
③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 2小時(shí),洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘,加終止液
⑤ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值,并計(jì)算出P/N比值。
⑶ 結(jié)果判定 已知陽(yáng)性血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知陽(yáng)性血清的OD值≥0.4;在上述條件成立的情況下,如果待檢血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待檢血清的OD值≥0.4,則判為陽(yáng)性,否則判為陰性。
雙抗體夾心
本法主要用于檢測(cè)大分子抗原�，F(xiàn)以檢測(cè)雞病毒(IBDV)的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。
① 加抗體包被 → 4℃過(guò)夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘,加終止液
⑤ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。
雙夾心ELISA
此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于:它是采用酶標(biāo)抗抗體檢查多種大分子抗原,它不僅不必標(biāo)記每一種抗體,還可提高試驗(yàn)的敏感性。此法的基本程序?yàn)?
① 加抗體(Ab-1)包被 → 4℃過(guò)夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原(Ag) → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加用非同種動(dòng)物生產(chǎn)的特異性抗體(Ab-2)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加入酶標(biāo)抗Ab-2抗體(AB-3)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
⑥ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。
競(jìng)爭(zhēng)ELISA
此法主要用于測(cè)定小分子抗原及半抗原,其原理類(lèi)似于放射測(cè)定。其基本程序?yàn)?
① 抗體包被 → 4℃過(guò)夜,洗滌三次、拋干
② 加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原(對(duì)照孔僅加酶標(biāo)抗原)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
④ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。
被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定,如果待檢溶液中抗原越多,被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少,有色產(chǎn)物就減少,這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測(cè);其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記,而且因?yàn)榭乖慕Y(jié)構(gòu)不同,還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外,試驗(yàn)中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。