大鼠淀粉樣體蛋白(APP)ELISA試劑盒

概述:

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)）是一種平板檢測(cè)技術(shù)，旨在檢測(cè)和定量肽、蛋白質(zhì)、抗體和激素等物質(zhì)。其他名稱，比如酶 免疫測(cè)定（EIA）也用于描述該的技術(shù)。在 ELISA 中，抗原必須固定化到固體表面，然后與連接到酶的抗體混合。通過 與適當(dāng)?shù)牡孜锓跤�，測(cè)量報(bào)告基因酶的活性來產(chǎn)生可測(cè)量的產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該檢測(cè)策略中的關(guān)鍵元素是高度特 異性的抗體-抗原相互作用。

ELISA試劑盒的特點(diǎn)有：

一、高效、靈敏、特異的抗體

二、節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)

三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體

四、適用血清、血漿、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標(biāo)本類型

五、穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性

ELISA 試劑盒主要保證規(guī)格概述

檢測(cè)內(nèi)精度

檢測(cè)內(nèi)驗(yàn)證顯示檢測(cè)板內(nèi)孔間的重現(xiàn)性。檢測(cè)內(nèi)驗(yàn)證產(chǎn)生的數(shù)據(jù)有助于確保在板的不同孔中檢測(cè)的樣品給出可比較結(jié)果。以下是為具有代表性的板內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)生成和報(bào)告的數(shù)據(jù)示例。在本示例中， 通過在同一檢測(cè)中檢測(cè)三個(gè)樣品各重復(fù) 14 次來評(píng)估 Invitrogen VCAM-1 人 ELISA 試劑盒。每個(gè)樣品的 %CV 表明該檢測(cè)具有良好的重現(xiàn)性。具有已知 Hu sVCAM-1 濃度的樣品重復(fù)檢測(cè)14 次，以確定檢測(cè)的精度。

檢測(cè)間精度

檢測(cè)間精度顯示不同日期進(jìn)行的檢測(cè)間重現(xiàn)性。檢測(cè)間精度通常為< 10%。這確保獲得的結(jié)果隨著時(shí)間的推移和試劑盒之間保持一致。以下是為檢測(cè)間精度生成和報(bào)告的典型數(shù)據(jù)示例。在該示例中， 使用 Invitrogen 淀粉樣蛋白 β 42 人 ELISA 試劑盒在多天內(nèi)檢測(cè)三份樣品，共檢測(cè) 36 次。結(jié)果顯示變異系數(shù)小于 10%，從而證明了檢測(cè)間良好再現(xiàn)性。

稀釋線性度

線性是相對(duì)于基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析物計(jì)算量來定義。樣品中分析物的終計(jì)算濃度應(yīng)與檢測(cè)定量范圍內(nèi)的任何稀釋濃度相同。開發(fā)完善的免疫檢測(cè)試劑盒可大限度地減少不同樣品基質(zhì)和其他可能干擾的因素的潛在影響。稀釋線性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提供了關(guān)于在不同稀釋水平下測(cè)試的樣品結(jié)果精度的信息。對(duì)每種經(jīng)驗(yàn)證樣品類型進(jìn)行稀釋線性測(cè)試，如果結(jié)果是每種稀釋預(yù)期濃度的 70%-130%，則視為良好。線性對(duì)于在測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)準(zhǔn)確測(cè)量分析物濃度非常重要，可使用公式計(jì)算：

% 線性度 = (稀釋后測(cè)量濃度 / 預(yù)期濃度) x 100

特定樣品類型的稀釋線性度通常如下表所示。在該示例中， 使用 HeLa 細(xì)胞裂解物評(píng)價(jià) Invitrogen c-Myc (總) 人 ELISA 試劑盒。在檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，用試劑盒隨附的標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液稀釋 HeLa 細(xì)胞裂解物。測(cè)量值與預(yù)期值顯示出良好的檢測(cè)線性，并且沒有來自樣品基質(zhì)的明顯干擾。

HeLa 細(xì)胞在 37°C 下，含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM 中生長(zhǎng)，并用 細(xì)胞提取緩沖液裂解，并進(jìn)行超聲處理。將該裂解物在標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液中稀釋至檢測(cè)范圍，并測(cè)量 c-Myc（總量）。檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期濃度的線性回歸檢測(cè)產(chǎn)生的相關(guān)系數(shù)為0.99。

ELISA 平行性

平行性提供了在給定 ELISA 中以相同方式檢測(cè)天然和重組樣品的確認(rèn)。平行性驗(yàn)證產(chǎn)生的數(shù)據(jù)確保給定分析物在天然樣品中以類似于標(biāo)準(zhǔn)曲線的劑量依賴性方式被識(shí)別。 

圖 1 顯示了 ELISA 試劑盒驗(yàn)證期間針對(duì)并行性生成的數(shù)據(jù)。在檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)連續(xù)稀釋重組標(biāo)準(zhǔn)品、大鼠血清和大鼠血漿，并使用我們的大鼠生長(zhǎng)激素 ELISA 試劑盒結(jié)果表明，稀釋緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)品可用于準(zhǔn)確定量測(cè)試基質(zhì)中的樣品濃度。

圖 1.大鼠生長(zhǎng)激素 ELISA 平行性
隨機(jī)大鼠血清和血漿樣品在標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液中連續(xù)稀釋。將每種稀釋液的光密度與大鼠生長(zhǎng)激素標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖。該標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確反映了天然樣品中大鼠生長(zhǎng)激素的含量。

ELISA 回收率

回收率用于確定分析物檢測(cè)是否受樣品基質(zhì)差異的影響�；|(zhì)（如血清和血漿）可能具有干擾因素，影響 ELISA 準(zhǔn)確定量分析物的能力。

通過將已知量的分析物加標(biāo)到不同樣品基質(zhì)中來驗(yàn)證回收率。進(jìn)行檢測(cè)并確定回收率。通常，如果平均回收率為 80%-120%，則認(rèn)為樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確定量分析物的能力影響小。 

右表是用于報(bào)告回收率的典型格式。在該示例中，   檢測(cè)了 Invitrogen 脂聯(lián)素人 ELISA 試劑盒在 5 份不同血漿樣品中的回收率。 

ELISA 靈敏度

靈敏度定義為可與背景區(qū)分的低分析物水平。這通常稱為分析靈敏度或檢測(cè)限。通過將零標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)獲得的平均 O.D. 加上 2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差來確定靈敏度。

例如， Invitrogen Tau (磷酸化) [pT181] 人 ELISA KI 靈敏度 <為 10 pg/mL。這表明測(cè)試的每個(gè)試劑盒批次的靈敏度均低于 10pg/mL。用于報(bào)告 ELISA 測(cè)定靈敏度的典型規(guī)格是 " 人 Tau [pT181] <的低檢測(cè)濃度為 10 pg/mL。這通過零標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè) 64 次時(shí)獲得的平均 O.D. 加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差來確定。

ELISA 特異性

進(jìn)行特異性測(cè)試以驗(yàn)證檢測(cè)到的目標(biāo)分析物與其他密切相關(guān)的分子未發(fā)生交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果或不準(zhǔn)確定量。為了確保僅識(shí)別所需的分析物，對(duì)一組其他物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)性測(cè)試。

例如， 通過篩選 20 種不同物質(zhì)的交叉反應(yīng)性，對(duì) Invitrogen IL-6 小鼠 ELISA 試劑盒的特異性進(jìn)行了檢測(cè)。用于報(bào)告 ELISA 特異性結(jié)果的典型格式是 " 使用 IL-6 小鼠 ELISA 試劑盒檢測(cè)了一組 10 ， 000 pg/mL 的物質(zhì)的緩沖溶液。 1β γ 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)無交叉反應(yīng)性：小鼠 IL-1 β ， IL-2 ， IL-4 ， IL-10 ， IFN- β ， TNF- α ；大鼠 1β IL-1 β ， IL-2 ， IL-4 ， IL-6 ， IFN- γ ， TNF- α ；人 IL-2 ， IL-4 ， IL-6 ， IL-10 ， IL-12 ， IFN- γ ， TNF- α ；豬 IL-8

ELISA 質(zhì)量控制

ELISA 的生產(chǎn)過程涉及高質(zhì)量生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，以確保高質(zhì)量 ELISA 試劑盒的一致生產(chǎn)�；疽蛩匕�—嚴(yán)格的文檔和記錄保存，人員培訓(xùn)，質(zhì)量控制程序，設(shè)施和設(shè)備維護(hù)，關(guān)鍵流程的驗(yàn)證，原材料控制，可追溯性，環(huán)境監(jiān)測(cè)，變更控制， 和符合監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)。 

ELISA 移液和洗滌技術(shù)技巧

移液技巧

1. 使用符合制造商建議范圍內(nèi)的正確移液器

2. 確認(rèn)吸頭已牢固地插與移液器上

3. 確認(rèn)移液時(shí)沒有氣泡

4. 在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，樣品或試劑之間更換吸頭

5. 每種試劑使用不同的儲(chǔ)液槽

6. 將樣品吸取到孔的側(cè)面，避免飛濺

7. 始終進(jìn)行樣品 / 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)孔設(shè)置

洗滌流程

1. 通過將吸頭輕輕地降低到每個(gè)孔底部，完全吸液所有孔中的液體。
    備注：小心操作，不要?jiǎng)潅變?nèi)側(cè)。

2. 用至少 400 μ L µL 的洗滌緩沖液填充孔

3. 浸泡 15 到 30

4. 從孔中吸出洗滌緩沖液

5. 按照提示重復(fù)方案 (通常 3-4 次)

6. 清洗完成后，翻轉(zhuǎn)孔板并在吸水組織上輕敲 (必要時(shí)用力) 干燥。確保清除所有殘留的液體。

7. 或者，也可使用洗瓶或自動(dòng)洗板機(jī)。請(qǐng)務(wù)必 遵循上述內(nèi)容。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 使用將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在37oC溶解。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為2000pg/mL。準(zhǔn)備7個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管，每個(gè)EP管中加入150μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成不同的梯度， 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3. 濃洗滌液：用580mL蒸餾水或去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL，進(jìn)行30倍稀釋。

注意事項(xiàng)劑盒的儲(chǔ)存

1. 未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請(qǐng)注意，收到試劑盒后請(qǐng)盡快將TMB 洗滌液，終止液保存于4℃，其他試劑保存于-20℃。

2. 使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃，避免潮濕。

須知：

試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在驗(yàn)后1個(gè)月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時(shí)間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

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原創(chuàng)作者：上海篤瑪生物科技有限公司