雞淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原3(LFA-3/CD58)ELISA試劑盒

酶免ELISA試劑盒是一種常用的學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，常用于抗原或的定量檢測(cè)。這種試劑盒利用酶聯(lián)吸附法（ELISA）技術(shù)，將已知的抗原或吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。ELISA試劑盒具有高靈敏度、高特、快速、易操作等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和化學(xué)等域廣泛應(yīng)用。

ELISA試劑盒的操作步驟如下：1.包被：用PH9.6的CBS包被液稀釋包被抗原至5μg/ml，酶標(biāo)板中每孔加入50μl，室溫、4℃或37℃過(guò)夜包被。2.洗滌：棄包被液（拍干，再用無(wú)塵紙吸干），用PH7.2-7.4的1×PBST洗滌液洗板3次（每孔均要加滿），每次3min~5min。3.封閉：每孔加封閉液（1%BSA）250μl，37℃封閉2h。4.洗滌：用1×PBST洗滌液洗板3次，每次3min~5min。5.結(jié)合一抗：用1×PBST緩沖液1∶1000稀釋被檢，每孔100μl，要設(shè)立陰性對(duì)照，37℃孵育1.5h。6.洗滌：同上。7.結(jié)合酶標(biāo)二抗：每孔加1×PBST緩沖液1000倍稀釋的酶標(biāo)二抗羊抗鼠IgG-HRP（稀釋倍數(shù)根據(jù)產(chǎn)品不同有所不同，可按說(shuō)明書進(jìn)行）50μl，37℃孵育1h.8.洗滌：同上。9.顯色：每孔加底物溶液（TMB）50μl，置室溫避光顯色10min。10.待顯色后，每孔加入50μl終止液（2mol/L H2SO4）終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀讀取450nm的OD值，以確定水平。以上步驟僅供參考，具體操作請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況和產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

試劑盒操作步驟：

   實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，請(qǐng)?zhí)崤渲煤盟性噭�，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做曲線。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、孔、待測(cè)樣品孔�？瞻卓准訕悠废♂屢�100μl，余孔分別加品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。 為實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的品溶液。

2.棄去，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記加99μl生物素標(biāo)記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)可見(jiàn)品的3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

雞淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原3(LFA-3/CD58)ELISA試劑盒

ELISA試劑盒基于抗原之間的特異結(jié)合反應(yīng)，以用于測(cè)定的抗原通常為各種純化抗原，而則為純化抗原動(dòng)物后的多克隆和使用雜交瘤技術(shù)的單克隆，而抗原或的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過(guò)各種化學(xué)合成制備。ELISA試劑盒的作用ELISA試劑盒是一種用于體外定性檢測(cè)人或中的特定的試劑盒，例如抗人類戊型（HEV）IgMELISA檢劑盒。ELISA試劑盒具有靈敏度高、特好、操作簡(jiǎn)便、安全、快速等優(yōu)點(diǎn)，可以用于檢測(cè)類因子、、等，在臨床診斷、科研和生物制品檢測(cè)等域具有廣泛的應(yīng)用。

標(biāo)本的采集及保存：

• ：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

• ：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

• 細(xì)胞物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 (注：標(biāo)本溶血會(huì)影響**檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。)

• 標(biāo)本的稀釋原則：通過(guò)文獻(xiàn)檢索的了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

• 品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為濃度0 pg/ml，臨用15分鐘內(nèi)配制。 如配制150 pg/ml品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

• 生物素標(biāo)記的稀釋原則：臨用以生物素標(biāo)記稀釋液稀釋，稀釋根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標(biāo)記加990μl生物素標(biāo)記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時(shí)內(nèi)配制。

• 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用小時(shí)內(nèi)配制

注意事項(xiàng)：

1.當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2.洗滌非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。

3.一次加樣時(shí)間**控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，建議使用排槍加樣。

4.請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做曲線，做復(fù)孔。

5.如標(biāo)本中待測(cè)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)乘以稀釋倍數(shù)。

6.在配制品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7.底物請(qǐng)避光保存。

8.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

試劑盒性能

1．準(zhǔn)確性：品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2．靈敏度檢測(cè)濃度小于10 pg/ml。

3．特：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4．重復(fù)性：批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于9%和15%。

原創(chuàng)作者：上海篤瑪生物科技有限公司