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查找:Green Fluorescent Protein (GFP) Antibody
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綠熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP),又稱綠色熒光蛋白,早是由下村修等人在1962年在一種學名Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)。其基因所產生的蛋白質,在藍色波長范圍的光線激發(fā)下,會發(fā)出綠色熒光。這個發(fā)光的過程中還需要冷光蛋白質Aequorin的幫助,且這個冷光蛋白質與鈣離子(Ca2+)可產生交互作用。由于具有自發(fā)熒光等特性,在分子生物學和細胞生物學域得到廣泛應用。GFP作為一種報告分子,在檢測蛋白表達、蛋白和細胞熒光示蹤、研究蛋白質之間相互作用和構象變化中,起到了重要的作用。
構造組成
由水母Aequoreavictoria中發(fā)現(xiàn)的野生型綠熒光蛋白,395nm和475nm分別是 和次大的激發(fā)波長,它的發(fā)射波長的峰點是在509nm,在可見光綠光的范圍下是較弱的位置。由海腎(seapansy)所得的綠熒光蛋白,僅有在498nm有一個較高的激發(fā)峰點。
在細胞生物學與分子生物學域中,綠熒光蛋白基因常被用作為一個報告基因(reportergene)。一些經修飾過的型式可作為生物探針,綠熒光蛋白基因也可以克隆到脊椎動物,并拿來映證某種假設的實驗方法。
蛋白形態(tài)
綠熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形,就像一個桶,負責發(fā)光的基團位于桶中央,因此,綠熒光蛋白可形象地比喻為一個裝有色素的“油漆桶”。裝在“桶”中的發(fā)光基團對藍色光照特別敏感。當它受到藍光照射時,會吸收藍光的部分能量,然后發(fā)射出綠色的熒光。利用這一性質,生物學家們可以用綠熒光蛋白來標記幾乎任何生物分子或細胞,然后在藍光照射下進行顯微鏡觀察。原本黑暗或透明的視場馬上變得星光點點——那是被標記了的活動目標。對生物活體樣本的實時觀察,在綠熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)和應用以,是根本不可想象的。而這種 改變了生物學研究的蛋白質,初是從一種廣泛生活于太平洋海域的發(fā)光水母體內分離得到的。
在大自然中,具有發(fā)光能力的生物有不少,螢火蟲是陸地上為我們所熟悉的發(fā)光生物,中國古代還有“捕螢數(shù)百入囊內照明夜讀”的佳話。在海洋里,某些水母、珊瑚和深海魚類也有發(fā)光的能力。特別是有的肉食性魚類門靠一條閃著熒光的觸角來把其他小魚吸引到自己的嘴邊,《海底總動員》里就有這種魚。事實上,大多數(shù)發(fā)光動物能發(fā)光是靠兩種物質——熒光素和熒光素酶——合作產生的結果。不同發(fā)光生物的熒光素和熒光素酶結構是不一樣的。因此,這些生物的發(fā)光本只能是它們自己的“利”。
20世紀60年代,一位日本科學家從美國西岸打撈了大量發(fā)光水母,帶回位于華盛頓州的實驗室進行研究。這些水母在受到外界的驚擾時會發(fā)出綠色的熒光,這位科學家希望找到這種水母的熒光素酶。然而,經過長期的重復努力,居然毫無收獲。他大膽地假設,這種學名叫Aequoreavictoria的水母能發(fā)光也許并不是常規(guī)的熒光素/熒光素酶原理。他想,可能存在有另一種能產生熒光的蛋白。此后,他進行了更多的實驗,終于搞清楚了這種水母的特殊發(fā)光原理。原來,在這種水母的體內有一種叫水母素的物質,在與鈣離子結合時會發(fā)出藍光,而這道藍光未經人所見就已被一種蛋白質吸收,改發(fā)綠色的熒光。這種捕獲藍光并發(fā)出綠光的蛋白質,就是綠熒光蛋白。這位日本科學家也因為這項發(fā)現(xiàn),獲得了剛剛頒發(fā)的諾貝爾化學獎,他就是日本科學家下村修。

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蛋白作用
綠熒光蛋白的發(fā)光機理比熒光素/熒光素酶要簡單得多。一種熒光素酶只能與相對應的一種熒光素合作來發(fā)光,而綠熒光蛋白并不需要與其他物質合作,只需要用藍光照射,就能自己發(fā)光。
在生物學研究中,科學家們常常利用這種能自己發(fā)光的熒光分子來作為生物體的標記。將這種熒光分子通過化學方法掛在其他不可見的分子上,原來不可見的部分就變得可見了。生物學家一直利用這種標記方法,把原本透明的細胞或細胞器從黑暗的顯微鏡視場中“揪出來”。
傳統(tǒng)的熒光分子在發(fā)光的同時,會產生具有毒性的氧自由基,導致被觀察的細胞死亡,這叫做“光毒性”,因此,在綠熒光蛋白發(fā)現(xiàn)以,科學家們只能通過熒光標記來研究死亡細胞靜態(tài)結構,而綠熒光蛋白的光毒性非常弱,非常適合用于標記活細胞。
然而,綠熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)20多年后,才有人將其應用在生物樣品標記上。1993年,馬丁·沙爾菲成功地通過基因重組的方法使得除水母以外的其他生物(如大腸桿菌等)也能產生綠熒光蛋白,這不僅證實了綠熒光蛋白與活體生物的相容性,還建立了利用綠熒光蛋白研究基因表達的基該方法,而許多現(xiàn)代重大疾病都與基因表達的異常有關。至此,生物的一場“綠色革命”揭開了序幕。
后來,美籍華人錢永健系統(tǒng)地研究了綠熒光蛋白的工作原理,并對它進行了大刀闊斧的化學改造,不但大大增強了它的發(fā)光效率,還發(fā)展出了紅色、藍色、黃色熒光蛋白,使得熒光蛋白真正成為了一個琳瑯滿目的工具箱,供生物學家們選用。生物實驗室普遍使用的熒光蛋白,大部分是錢永健改造的變種。
有了這些熒光蛋白,科學家們就好像在細胞內裝上了“攝像頭”,得以實時監(jiān)測各種病毒“為非作歹”的過程。通過沙爾菲的基因克隆思路,科學家們還培育出了熒光老鼠和熒光豬,由于沙爾菲與錢永健的突出貢獻,他們與綠熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)者下村修共享了2008年的諾貝爾化學獎。
瑞典皇家科學院將綠熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和改造與顯微鏡的發(fā)明相提并論,成為當代生物科學研究中重要的工具。
原創(chuàng)作者:上海篤瑪生物科技有限公司