兔血小板球蛋白β(βTG/PBP/CXCL7/NAP2)ELISA試劑盒

使用說(shuō)明書(shū)

檢測(cè)原理

試劑盒采用雙一步夾心法酶聯(lián)吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被白蛋白（ALB）的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)，經(jīng)過(guò)溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的白蛋白（ALB）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

自從Engvall和Perlman(1971）報(bào)道建立酶聯(lián)吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以來(lái)，由于ELISA具有快速、、簡(jiǎn)便、易于化等優(yōu)點(diǎn)，使其迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。盡管早期的ELISA由于特不夠高而妨礙了其在實(shí)際中應(yīng)用的步伐，但隨著的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新，尤其是采用基因工程制備包被抗原，采用針對(duì)某一抗原表位的單克隆進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，都大大了ELISA的特，加之電腦化程度的ELISA檢測(cè)儀的使用，使ELISA更為簡(jiǎn)便實(shí)用和化，從而使其成為廣泛應(yīng)用的檢測(cè)。如ELISA已被廣泛應(yīng)用于多種和等的診斷。在動(dòng)物檢疫方面，ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結(jié)核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽、藍(lán)舌病等的診斷中已為廣泛采用的。

試劑盒組成：自備物品1. 酶標(biāo)儀（450nm）2. 加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3. 37℃恒溫箱

樣品收集、處理及保存

1.  ：使用不含熱原和內(nèi)的試管，操作中避免任何細(xì)胞，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.  ：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

辣根過(guò)氧化物酶：過(guò)氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含，從辣根中提取的稱辣根過(guò)氧化物酶（HRP），是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個(gè)酸組成，等電點(diǎn)為pH 3-9，催化反應(yīng)的適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的銨溶液。酶蛋白和輔基吸收光譜分別為275nm和403nm。

兔血小板球蛋白β(βTG/PBP/CXCL7/NAP2)ELISA試劑盒

操作注意事項(xiàng)

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正�，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。

2.  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.  濃度為0的S0號(hào)品即可視為陰性對(duì)照或者空白；按照說(shuō)明書(shū)操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍，終結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。

4.  嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.  所有組分使用充分搖勻。

試劑盒組成

注：品（S0-S5）濃度依次為：0、6.25、12.5、25、50、100 mg/mL

試劑的

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板

1.  手工洗板：甩盡孔內(nèi)，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置品孔和樣本孔，品孔各加不同濃度的品50μL；

3.  樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

 繪制曲線：在Excel工作表中，以品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

ELISA：本法主要用于檢測(cè)型特。該現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測(cè)。下面以AP2型的ELISA檢測(cè)法為例介紹其操作程序：① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干② 用200μl緩沖液進(jìn)行封閉 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干③ 加工作量1:4稀釋被檢豬100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干④ 加100μl工作量兔抗AP2型 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液⑦ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。本試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照、兔抗AP2型陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照。

試劑盒性能

1.  準(zhǔn)確性：品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度檢測(cè)濃度小于1.0 mg/mL。

3.  特：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.  重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個(gè)月

免責(zé)聲明

1.   試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)，本公司概不負(fù)責(zé)。

2.   嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，實(shí)驗(yàn)者違反說(shuō)明書(shū)操作，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。

原創(chuàng)作者：上海篤瑪生物科技有限公司