兔嗜酸性白血球相關(guān)之RNA水解酵素家族成員1(EAR1)ELISA試劑盒

操作步驟：1.從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。2. 設(shè)置品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；品孔各加不同濃度的品 50μL；3. 待測樣本孔先加待測樣本 10μL，再加樣本稀釋液 40μL；4. 隨后品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測 50μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。5. 棄去，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗 板 5 次（也可用洗板機洗板）。6. 所有孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。7. 所有孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。

試劑盒組成：

注意：使用請檢查試劑盒中試劑的標簽和數(shù)量與表格是否一致。

兔嗜酸性白血球相關(guān)之RNA水解酵素家族成員1(EAR1)ELISA試劑盒

點ELISA：與常規(guī)的微量板ELISA比較，Dot-ELISA具有簡便、節(jié)省抗原等優(yōu)點，而且結(jié)果可長期保存；但其也有不足，主要是在結(jié)果判定上比較主觀，特不夠高等。該的主要操作程序為：⑴載體膜的預(yù)處理及抗原包被　取纖維素膜用蒸餾水浸泡后，稍加干燥進行壓圈。將陰性、陽性抗原及被檢測抗原適度稀釋后加入圈中，置37℃使纖維素膜干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點加40－53個樣品，每個壓圈可加抗原液1－20μl。⑵ 封閉　將纖維素膜置于封閉液中，37℃感作15－30分鐘。封閉液多采用含有正常動物、pH7.2或pH7.4的PBS。⑶ 加被檢　可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢，37℃反應(yīng)一定時間，用洗滌液洗三次，每次1－3分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。⑷ 加酶標，37℃反應(yīng)一定時間后，用洗滌液洗三次。⑸顯色　加入新鮮配制的底物液，37℃反應(yīng)一定時間后，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。⑹ 結(jié)果判定　以陽性、陰險作為對照，膜片出現(xiàn)深棕紅色點者為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。

試劑盒操作步驟：

   實驗開始，請?zhí)崤渲煤盟性噭�，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、孔、待測樣品孔�？瞻卓准訕悠废♂屢�100μl，余孔分別加品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。 為實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的品溶液。

2.棄去，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記工作液 100μl（取1μl生物素標記加99μl生物素標記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時可見品的3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

標本的采集及保存：

• ：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

• ：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

• 細胞物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 (注：標本溶血會影響**檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。)

• 標本的稀釋原則：通過文獻檢索的了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的中，應(yīng)做好詳細的記錄。計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

• 品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為濃度0 pg/ml，臨用15分鐘內(nèi)配制。 如配制150 pg/ml品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

• 生物素標記的稀釋原則：臨用以生物素標記稀釋液稀釋，稀釋根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標記加990μl生物素標記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配制。

• 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：臨用以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配置

雙夾心ELISA：此法與雙夾心ELISA的主要區(qū)別在于：它是采用酶標抗檢查多種大分子抗原，它不僅不必標記每一種，還可試驗的性。此法的基本程序為：① 加（Ab-1）包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干② 加待檢抗原（Ag） → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干③ 加用非同種動物生產(chǎn)的特（Ab-2)→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干④ 加入酶標抗Ab-2（AB-3）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液⑥ 用ELISA檢測儀測定OD值。

實驗結(jié)果計算：

    以物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出曲線，根據(jù)樣品的OD值由曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用物的濃度與OD值計算出曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

繪制曲線：在Excel工作表中，以品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

注意事項：

1.當混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2.洗滌非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3.一次加樣時間**控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，建議使用排槍加樣。

4.請每次測定的同時做曲線，做復(fù)孔。

5.如標本中待測含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請乘以稀釋倍數(shù)。

6.在配制品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7.底物請避光保存。

8.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

試劑盒性能

1．準確性：品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2．靈敏度檢測濃度小于10 pg/ml。

3．特：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4．重復(fù)性：批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和15%。

原創(chuàng)作者：上海篤瑪生物科技有限公司