實(shí)驗(yàn)原理

ELISA實(shí)驗(yàn)原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合,此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性,也不影響酶的生物學(xué)活性。

ELISA的發(fā)展史:
1√ 目,分子生物學(xué)正在并肯定會(huì)讓我們對(duì)整個(gè)生命科學(xué)有一個(gè)全面而*的認(rèn)識(shí),其對(duì)免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的。

2√ ELISA測(cè)定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展,而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步更新和型標(biāo)記物的應(yīng)用。

3√ ELISA試劑盒它使我們對(duì)以一些難以檢測(cè)的生物活性物質(zhì)的測(cè)定變得輕而易舉,并且大大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。

新手實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):
新手以及那些沒(méi)有固定協(xié)作供貨商的顧客購(gòu)買時(shí)往往有兩種疑慮,要便是價(jià)格,其次,便是質(zhì)量,國(guó)內(nèi)試劑盒相關(guān)于進(jìn)口試劑盒來(lái)說(shuō)價(jià)格自然會(huì)低許多。

關(guān)于新手的視點(diǎn)來(lái)說(shuō)價(jià)格低并不必定就會(huì)考慮購(gòu)買,同時(shí)還在猶疑質(zhì)量問(wèn)題,由于沒(méi)有用過(guò)新品牌的試劑盒心中總是在懷疑。

利用交叉實(shí)驗(yàn)即可辨別是否造假:小鼠ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
1、取出購(gòu)買的試劑盒A的包被板兩條。
2、一條包被板加試劑盒A的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3、另一條包被板加試劑盒B的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4、后續(xù)操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,加檢測(cè)抗體、酶復(fù)合物和底物。

我司在科研域積累了豐富的經(jīng)驗(yàn),正是為了幫助中國(guó)的相關(guān)單位能夠利用我司的經(jīng)驗(yàn)與技術(shù)優(yōu)勢(shì),為中國(guó)民眾提供更安全,快捷的生命域。

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做ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)需要重點(diǎn)注意的細(xì)節(jié)問(wèn)題:
1、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個(gè)比較大的跨度,并且要能涵蓋你所要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品的濃度,即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi),包括上限和下限;而對(duì)于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線,盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度陡段,即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
2、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí),應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行,以減少高濃度對(duì)低濃度的影響,提高準(zhǔn)確性。
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個(gè)點(diǎn),但至少要保證有5個(gè)點(diǎn)。
4、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動(dòng),但一般來(lái)說(shuō),相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98,對(duì)于有些實(shí)驗(yàn),至少要0.99甚至是0.999。
5、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來(lái)的,所以先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事,否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)從談起。
6、好采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度,這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會(huì)出現(xiàn)較大的偏離。

操作步驟:

1. 包被過(guò)程(注意設(shè)置空白對(duì)照,陰性對(duì)照):

將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當(dāng)濃度(一般所需抗原包被量為每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;棄去孔中液體.(為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋或?qū)迤椒旁诘撞坑袧窦啿嫉慕饘贊窈兄?

2. 封閉酶標(biāo)反應(yīng)孔:

5%小牛血清置37℃封閉40min.封閉時(shí)將封閉液加滿各反應(yīng)孔,并去除各孔中的氣泡,封閉結(jié)束后用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.
洗滌方法:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,將洗滌液注滿板孔,放置2min略作搖動(dòng),吸干孔內(nèi)液,傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌次數(shù)3次

3. 加入待檢測(cè)樣品(建立合適的濃度梯度):

檢測(cè)時(shí)一般采用1:50-1:400的稀釋度, 應(yīng)采用較大稀釋體積進(jìn)行,一般保證樣品吸取量>20μl.
將稀釋好的樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中,每樣品至少加雙孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.

4. 加入酶標(biāo)抗體:

酶標(biāo)抗體: 根據(jù)酶結(jié)合物提供商提供的參考工作稀釋度進(jìn)行. 37℃,30-60min之間.短于30min往往結(jié)果不穩(wěn)定.每孔加100μl.洗滌同。

5. 加入底物液(現(xiàn)用現(xiàn)配):

TMB-過(guò)氧化氫尿素溶液,OPD-過(guò)氧化氫底物液系統(tǒng)次之.
底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分鐘,加入終止液顯色.

6. 終止反應(yīng):

每孔加入終止液50μl終止反應(yīng),于20min內(nèi)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

7. 結(jié)果判斷:

OPD顯色后采用492nm波長(zhǎng),TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)需要450nm波長(zhǎng).檢測(cè)時(shí)一定要行空白孔系統(tǒng)調(diào)零.用測(cè)定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測(cè)定孔平均值的比值(P/N)表示,當(dāng)P/N大于2時(shí)作為抗體的效價(jià).(數(shù)值的大小依具體檢測(cè)要求而定.)

相關(guān)產(chǎn)品:

原創(chuàng)作者：上海篤瑪生物科技有限公司